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문제 정의
- 정상 전복조직에서 Prx 2 mRNA의 발현과 비브리오균을 감염시킨 전복의 간췌장과 혈구에서 시간에 따른 Prx 2의 발현변화를 분석하였다. 본 연구를 통하여 참전복의 선천성면역 반응에 관한 기초 자료로 활용하고자 하며 향후 병원균 감염에 대한 바이오마커로의 활용 가능성에 대해 알아보고자 한다.
- 본 연구에서는 참전복의 Prx 2 염기서열을 동정하고 분석한 후 발현양상을 알아봄으로써 참전복 Prx 2의 기능을 알아보고자 하였다. 참전복의 597 bp 의 염기서열로부터 번역된 아미노산 서열에서 효소활성에 중요한 Prx의 특징적인 부분(motif I, motif II, region I과 region II)과 peroxidatic Cys와 resolving Cys를 포함한 주요 잔기들이 존재하였고 종간에 매우 보존되어 있었다.
제안 방법
- -80°C 에 보관한 각각의 샘플은 TRIzol reagent (Invitrogen)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 1 ug의 RNA로부터 transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche)와 oligo (dT) primer를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 참전복의 조직에서 Prx 2 유전자의 발현은 cDNA 서열을 기초로 제작한 프라이머를 이용하여 RT-PCR과 quantitative real time-PCR (qPCR)로 확인하였다.
- 참전복 조직(외투막, 아가미, 근육, 간췌장, 혈구)에서 RNAseq 분석을 수행하였다(data not shown). De novo assembly를 진행한 후 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용한 대용량 시퀀스 분석을 통하여, 까막전복 Prx 2 유전자(EF103377.1)와 아미노산 수준에서 상동성을 가지는 약 303 bp의 Prx 2 cDNA단편을 찾았다. 전장 Prx 2 cDNA 클로닝을 위해서, 303 bp의 Prx 2 cDNA단편의 염기서열을 기초로 한 Prx 2 유전자 특이프라이머를 디자인하였으며 (Prx 2 ORF-F1 : 5’-ATG GCC CAA GTC GGA AAC CTC CA-3’, Prx 2 ORF-F2 : 5’-ATG AAG ATT CCT CTC CTG GC-3’, Prx 2 ORF-R : 5’-TCA GTT GAC CTT GGA GAA GT-3’), SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech)를 이용하여 5’-과 3’-말단의 염기서열을 확보하였다.
- Prx 2의 염기서열과 아미노산서열의 비교를 위해 NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하였다. NCBI 데이터베이스에서 연체동물문에 속하는 생물 및 기타 생물들의 유사서열을 찾은 후, 상동성이 높은 아미노산 서열을 참고서열로 활용하였다. 참전복의 Prx 2와 참고서열을 MEGA 4.
- qPCR 조건은 다음과 같다: Taq activation step, 95°C, 10분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 10초, 57°C 5초, 72°C 30초; 40회 반복. PCR cycle이 끝난 후, 온도를 단계적으로 증가시켜 melting-curve를 분석하였다. 참전복 Prx 2 유전자의 상대적인 발현량은 2-ΔΔCT 방법[32]으로 결정하였고 참전복 18S rRNA 유전자를 내재 표준 유전자로 이용하였다.
- 확보된 5’-과 3’-말단의 유전자 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝하여, Escherichia coli strain XL1-blue로 형질전환하였다. Plasmid purification kit (Intron)로 plasmid를 정제한 후 자동염기 서열분석기(AB-3730XL, Applied Biosystems)로 염기서열을 결정하였다.
- 증폭된 PCR산물은 ethidium bromide (100 ng/ml)이 섞인 3% 아가로즈젤에 전기영동하여 확인하였다. qPCR은 FastStart DNA Master SYBR Green I을 이용하여 LightCycler system (Roche Diagnostics)에서 수행하였다. qPCR 조건은 다음과 같다: Taq activation step, 95°C, 10분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 10초, 57°C 5초, 72°C 30초; 40회 반복.
- 2×108 cells)의 농도로 근육 주사하였으며, 대조군은 동량의 PBS를 근육 주사하였다. 균을 주사한 후 0, 1, 3, 6, 9, 12시간마다 세마리씩 선별하여 외투막, 아가미, 근육, 패각근, 간췌장, 족부, 소화관 조직을 적출하였다. 그 후 즉시 액체질소로 고정하였으며 RNA 분리를 위해 -80°C에 보관하였다.
- 배양된 균은 phosphate buffered saline (PBS)에 희석한 후 sub-lethal dose (1.2×108 cells)의 농도로 근육 주사하였으며, 대조군은 동량의 PBS를 근육 주사하였다.
- 8배 더 높았다. 병원균 감염으로 항산화효소의 발현이 유도되는지 알아보기 위해 비브리오 균을 감염시킨 후, Prx 2 mRNA의 발현을 확인해 보았다. 비브리오균을 감염시킨 참전복의 간췌장과 혈구세포에서 Prx 2의 발현이 유도되었다(Fig.
- 본 연구에서는 참전복(Haliotis discus hannai)의 Prx 2 유전자의 단편을 대용량 염기서열 분석으로 확보한 후, 유전자의 전체 염기서열을 확인하고 아미노산 서열을 분석하였다. 정상 전복조직에서 Prx 2 mRNA의 발현과 비브리오균을 감염시킨 전복의 간췌장과 혈구에서 시간에 따른 Prx 2의 발현변화를 분석하였다.
- 전장 Prx 2 cDNA 클로닝을 위해서, 303 bp의 Prx 2 cDNA단편의 염기서열을 기초로 한 Prx 2 유전자 특이프라이머를 디자인하였으며 (Prx 2 ORF-F1 : 5’-ATG GCC CAA GTC GGA AAC CTC CA-3’, Prx 2 ORF-F2 : 5’-ATG AAG ATT CCT CTC CTG GC-3’, Prx 2 ORF-R : 5’-TCA GTT GAC CTT GGA GAA GT-3’), SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech)를 이용하여 5’-과 3’-말단의 염기서열을 확보하였다.
- 본 연구에서는 참전복(Haliotis discus hannai)의 Prx 2 유전자의 단편을 대용량 염기서열 분석으로 확보한 후, 유전자의 전체 염기서열을 확인하고 아미노산 서열을 분석하였다. 정상 전복조직에서 Prx 2 mRNA의 발현과 비브리오균을 감염시킨 전복의 간췌장과 혈구에서 시간에 따른 Prx 2의 발현변화를 분석하였다. 본 연구를 통하여 참전복의 선천성면역 반응에 관한 기초 자료로 활용하고자 하며 향후 병원균 감염에 대한 바이오마커로의 활용 가능성에 대해 알아보고자 한다.
- RT-PCR 조건은 다음과 같다: Pre-denaturation 95°C, 5분; denaturation, annealing, extension 각각 95°C 30초, 55°C 30초, 72°C 30초, 35회; extention 72°C, 10분. 증폭된 PCR산물은 ethidium bromide (100 ng/ml)이 섞인 3% 아가로즈젤에 전기영동하여 확인하였다. qPCR은 FastStart DNA Master SYBR Green I을 이용하여 LightCycler system (Roche Diagnostics)에서 수행하였다.
- 참전복 조직(외투막, 아가미, 근육, 간췌장, 혈구)에서 RNAseq 분석을 수행하였다(data not shown). De novo assembly를 진행한 후 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용한 대용량 시퀀스 분석을 통하여, 까막전복 Prx 2 유전자(EF103377.
- 참전복 조직에서 Prx 2 유전자의 mRNA 발현을 확인하고 병원균 감염에 따른 Prx의 발현변화를 분석함으로써 Prx 2의 기능을 알아보기 위해 qPCR을 수행하였다. 참전복 Prx 2의 mRNA는 실험에 사용된 모든 조직에서 관찰되었으며 외투막, 아가미, 간췌장, 족부, 소화관에서 높게 근육에서 낮게 발현되었다(Fig.
- 참전복의 전장 Prx 2 cDNA염기서열을 완성하기 위하여 Prx 2 단편과 5’- 및 3’-Rapid amplification of cDNA ends (RACE)로부터 확보된 염기서열을 조합하는 작업과 이로부터 아미노산 서열을 유추하는 작업은 GENETYX8.0 (SDS Software Development, Japan)프로그램을 이용하였고, 등전점과 분자량 예측은 ExPASy 웹사이트(http://web.expasy.org/compute_pi/)에서 예측된 아미노산 서열을 이용해서 분석하였다.
- 1 ug의 RNA로부터 transcriptor first strand cDNA synthesis kit (Roche)와 oligo (dT) primer를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 참전복의 조직에서 Prx 2 유전자의 발현은 cDNA 서열을 기초로 제작한 프라이머를 이용하여 RT-PCR과 quantitative real time-PCR (qPCR)로 확인하였다. 내재 표준 유전자로는 참전복 18S rRNA 유전자 accession no.
- 확보된 5’-과 3’-말단의 유전자 단편을 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝하여, Escherichia coli strain XL1-blue로 형질전환하였다.
대상 데이터
- AY319433; 18S rRNA F : 5’-CTC ACG GAA AGA GCG CGT TTA-3’, 18S rRNA R : 5’-GAC TTG CCC TCC AAT AGA TC-3’)를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 참전복(Haliotis discus hannai)은 국립수산과학원 육종연구센터에서 공급받아, 40리터 수조 내에서 18~20°C의 흐르는 해수에 일주일간 순치시킨 후, 외관상 건강한 개체(평균 중량; 50 g, 평균 각장; 62 mm, 평균 각폭; 45 mm, 평균 각고; 15 mm)를 선별하여 사용하였다.
데이터처리
- org/compute_pi/)에서 예측된 아미노산 서열을 이용해서 분석하였다. Prx 2의 염기서열과 아미노산서열의 비교를 위해 NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하였다. NCBI 데이터베이스에서 연체동물문에 속하는 생물 및 기타 생물들의 유사서열을 찾은 후, 상동성이 높은 아미노산 서열을 참고서열로 활용하였다.
- NCBI 데이터베이스에서 연체동물문에 속하는 생물 및 기타 생물들의 유사서열을 찾은 후, 상동성이 높은 아미노산 서열을 참고서열로 활용하였다. 참전복의 Prx 2와 참고서열을 MEGA 4.0 프로그램의 CLUSTALW 모듈을 이용하여 다중서열비교를 수행하였으며, phylogenetic analysis는 아미노산 서열에 기초한 Neighbor-Joining 알고리즘으로 분석하여 제작하였다.
이론/모형
- 3. Phylogenetic relationships of abalone Prx 2 proteins with those of other species, calculated using the neighbor-joining method. GenBank: human (Homo sapiens; NP 005800), mouse (Mus musculus; NP 035693), rat (Rattus norvegicus; AAH 58481), pig (Sus scrofa; NP 001231403), cow (Bos Taurus; AF305562), sheep (Ovis aries; NP 001159672), frog (Xenopus laevis; NP 001085414), zebrafish (Danio rerio; NP 001002468), salmon (Salmo salar; NP 001134858), croaker (Miichthys miiuy; AFX 74861), tuna (Thunnus maccoyii; ABW 88997), sea bream (Sparus aurata; ADI 78065) and shellfishes (Pinctada fucata; ADC35419, Cristaria plicata; ADM88874, Scylla paramamosain; ACO36036).
- 참전복 Prx 2 유전자의 상대적인 발현량은 2-ΔΔCT 방법[32]으로 결정하였고 참전복 18S rRNA 유전자를 내재 표준 유전자로 이용하였다.
성능/효과
- 참전복(Haliotis discus hannai)의 대용량 유전체 분석 사업을 통하여 100개의 아미노산을 코딩하는 303 bp의 Prx유전자 염기서열 일부를 확보할 수 있었다. BLAST search 결과, 확보된 염기서열은 참전복의 thioredoxin peroxidase 유전자의 부분서열(accession no. DQ118780.1)과 까막전복의 thioredoxin peroxidase 2 유전자(accession no. EF103377.1)와 99%의 상동성을 보였다. 확보된 303 bp의 염기서열을 바탕으로 유전자 특이프라이머를 제작한 후, 이를 이용하여 5’-및 3’-RACE 방법으로 총 1,052 bp의 전장 cDNA를 완성하였다.
- BLASTP 프로그램을 이용하여 참전복의 Prx 아미노산 서열을 NCBI 데이터베이스와 비교해 본 결과, 패류(ABO26635.1), 어류(ABW88997; AFX74861), 개구리(NP001085414), 초파리(AAF42986), 쥐(NP035693; AAH58481), 양(NP001159672), 돼지(NP001231403), 소(AAG53659), 사람(NP005800)를 포함한 다른 종과 약 64~99%의 유사성을 보였다(Table 1). 특히 참전복 Prx 2는 까막전복(Haliotis discus discus), 진주조개(Pinctada fucata) 그리고 귀이빨대칭이(Cristaria plicata)와 각각 99, 77, 80%의 유사성을 보였다(Table 1).
- 1). ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/) 웹사이트에서 분자량과 등전점을 분석한 결과 분자량은 22 kDa으로 등전점은 7.58로 예측되었다.
- Motif scan프로그램을 이용하여 참전복 Prx의 아미노산 서열을 분석한 결과, peroxiredoxin의 특징적인 motif 두 군데를 발견할 수 있었다. 효소활성을 조절하는 motif I (FYPLDFTFVCPTEI)과 motif II (GEVCPA)가 존재하였으며, 각각의 motif 내의 52, 173번 위치에 효소활성에 중요한 역할을 하는 2개의 cysteine잔기가 보존되어 있었다(Fig.
- 2). Multiple sequence alignments 결과를 토대로 MEGA 4 프로그램을 이용하여 참고서열과의 계통관계를 분석해본 결과, 크게 포유류와 양서류, 어류와 무척추동물군으로 나누어졌고 참전복 Prx 2는 연체동물과 갑각류와 하나의 그룹을 형성했다(Fig. 3).
- 특히 참전복 Prx 2는 까막전복(Haliotis discus discus), 진주조개(Pinctada fucata) 그리고 귀이빨대칭이(Cristaria plicata)와 각각 99, 77, 80%의 유사성을 보였다(Table 1). NCBI 데이터베이스에서 18개의 참고 서열을 선정하고 Clustal W 프로그램으로 multiple sequence alignments를 구축하여 비교해 본 결과, Prx의 특징적인 motif I, II, 그리고 N-말단과 C-말단의 cysteine 잔기 또한 종간에 매우 보존되어 있었다(Fig. 2). Multiple sequence alignments 결과를 토대로 MEGA 4 프로그램을 이용하여 참고서열과의 계통관계를 분석해본 결과, 크게 포유류와 양서류, 어류와 무척추동물군으로 나누어졌고 참전복 Prx 2는 연체동물과 갑각류와 하나의 그룹을 형성했다(Fig.
- 모든 실험은 3반복하였으며 데이터는 mean ± SD로 나타내었다.
- 본 연구결과를 정리해보면 참전복의 Prx 2는 아미노산 서열상에 항산화효소의 특징을 잘 보존하고 있었으며, 병원균의 인위감염 후 시간에 따른 발현 변화를 관찰한 결과, 병원균 감염에 대한 면역반응에도 관여함을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 무척추동물의 선천성 면역반응을 알아봄으로써 무척추동물에서 척추동물로의 선천성 면역시스템의 발달과정을 이해하는데 유용할 것이라 생각된다.
- 그러므로 참전복 Prx 2 역시 외부의 H2O2농도에 민감하게 반응할 수 있음을 시사한다. 염기서열과 아미노산 서열 분석결과를 볼 때, 참전복의 Prx 2는 typical 2-Cys Prx 타입으로 진화적으로 잘 보존되어 있었으며, 현재까지 보고된 포유류의 Prx 2와 유사한 기능을 할 것이라 예상된다.
- 참전복 조직에서 Prx 2 유전자의 mRNA 발현을 확인하고 병원균 감염에 따른 Prx의 발현변화를 분석함으로써 Prx 2의 기능을 알아보기 위해 qPCR을 수행하였다. 참전복 Prx 2의 mRNA는 실험에 사용된 모든 조직에서 관찰되었으며 외투막, 아가미, 간췌장, 족부, 소화관에서 높게 근육에서 낮게 발현되었다(Fig. 4A). 특히 아가미, 소화관과 간췌장에서 Prx 2의 발현양은 근육보다 106.
- 참전복 Prx 2의 조직 내 발현을 확인해 본 결과, 까막전복과 돌돔 (Oplegnathus fasciatus)을 포함한 어류와 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 참전복 Prx 2의 mRNA는 정상조직의 외투막, 아가미, 간췌장, 족부, 소화관에서 높게 발현되었다(Fig.
- 참전복(Haliotis discus hannai)의 대용량 유전체 분석 사업을 통하여 100개의 아미노산을 코딩하는 303 bp의 Prx유전자 염기서열 일부를 확보할 수 있었다. BLAST search 결과, 확보된 염기서열은 참전복의 thioredoxin peroxidase 유전자의 부분서열(accession no.
- 그러나 과도한 양의 ROS는 산화스트레스를 유발하기 때문에 산화스트레스를 최소화하고 면역반응을 효율적으로 조절하기 위해 패류에도 항산화시스템이 존재한다[2, 23, 35]. 참전복에서 병원성미생물 감염에 따른 항산화효소의 발현변화를 확인해본 결과, 비브리오균을 감염시킨 참전복의 간췌장과 혈구세포에서 Prx 2의 발현이 유도되었다(Fig. 4.). 이와 유사하게 Aeromonas hydrophila에 감염된 은어와 각시붕어, V.
- 4A). 특히 아가미, 소화관과 간췌장에서 Prx 2의 발현양은 근육보다 106.7배, 51.9배, 437.8배 더 높았다. 병원균 감염으로 항산화효소의 발현이 유도되는지 알아보기 위해 비브리오 균을 감염시킨 후, Prx 2 mRNA의 발현을 확인해 보았다.
- 1), 어류(ABW88997; AFX74861), 개구리(NP001085414), 초파리(AAF42986), 쥐(NP035693; AAH58481), 양(NP001159672), 돼지(NP001231403), 소(AAG53659), 사람(NP005800)를 포함한 다른 종과 약 64~99%의 유사성을 보였다(Table 1). 특히 참전복 Prx 2는 까막전복(Haliotis discus discus), 진주조개(Pinctada fucata) 그리고 귀이빨대칭이(Cristaria plicata)와 각각 99, 77, 80%의 유사성을 보였다(Table 1). NCBI 데이터베이스에서 18개의 참고 서열을 선정하고 Clustal W 프로그램으로 multiple sequence alignments를 구축하여 비교해 본 결과, Prx의 특징적인 motif I, II, 그리고 N-말단과 C-말단의 cysteine 잔기 또한 종간에 매우 보존되어 있었다(Fig.
- 확보된 303 bp의 염기서열을 바탕으로 유전자 특이프라이머를 제작한 후, 이를 이용하여 5’-및 3’-RACE 방법으로 총 1,052 bp의 전장 cDNA를 완성하였다.
후속연구
- 병원균 감염 시 항산화효소의mRNA 전사체의 발현이 변화한다는 것은 병원균 감염에 의한 산화스트레스 증가로 항산화효소의 전사가 증가할 것을 암시한다. 그러나 패류에서 병원균 감염 시 ROS가 생성되는 정도와 항산화효소의 발현과 활성은 종, 조직, 병원균의 종류에 따라 달랐고 mRNA발현 정도와 단백질 발현에도 차이가 있기 때문에 참전복 Prx 2의 발현뿐만 아니라 실제 효소활성도 알아보아야 할 것이며 특히 Prx와 같은 항산화효소의 경우 다양한 isoform이 있기 때문에 각 isoform의 발현과 활성에 대한 연구도 필요하다고 생각된다.
- 본 연구결과를 정리해보면 참전복의 Prx 2는 아미노산 서열상에 항산화효소의 특징을 잘 보존하고 있었으며, 병원균의 인위감염 후 시간에 따른 발현 변화를 관찰한 결과, 병원균 감염에 대한 면역반응에도 관여함을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 무척추동물의 선천성 면역반응을 알아봄으로써 무척추동물에서 척추동물로의 선천성 면역시스템의 발달과정을 이해하는데 유용할 것이라 생각된다.
- 그러므로 비브리오균 감염 시 전복 혈구에서 Prx의 발현이 증가하는 것은 참전복의 혈구 역시 병원균 감염에 의한 산화스트레스에 반응하며 Prx가 면역반응에 관여할 가능성을 시사한다. 실제 참전복 Prx 2가 간췌장과 혈구세포에서 효소 활성을 갖는지, 그리고 전복의 혈구세포가 PAMPs를 인지하여 면역반응을 하는데 관여하는지에 대한 연구는 후속연구로 필요할 것이다.
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