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제안 방법
- − CVB4 감염 HeLa cell에서 ORI2의 바이러스 유전자 증폭 억제 효과를 rt-PCR을 수행하여 막 단백질 VP1의 positive strain 농도를 측정하였다.
- − Cell survival assay를 통해 화합물의 항바이러스 활성을 실험하여 CVB4 증식 억제 물질을 선별하였다.
- − ORI2의 CVB4 증식을 배양세포 상등액의 생바이러스 농도를 PFU assay를 통해 확인하였다.
- − RNA 바이러스인 CVB4의 유전자 증폭을 검증하기 위해 TRIzol reagent(Invitrogen, USA) 로 세포를 분리하여 RNA를 추출하고 전체 추출물의 aliquot 중 2 µl를 주형으로 Maxime Reverse-transcription(RT) kit(IntronbBiotech, Inc., KOR)을 사용하여 RT를 수행하였다.
- − 오리방풀(Isodon excisus) 2.5 kg을 2주 동안 메탄올에 추출, 여과 후 농축하여, 얻어진 MeOH extract(39 g)를 증류수(1 L)에 현탁시켜, n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 순으로 분획 후, 그 중 가장 우수한 효과를 나타낸 EtOAc 분획물(5 g)을 CHCl3: MeOH=20:1부터 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였고, 이를 통해 얻은 활성분획(42 mg)을 HPLC(Shisheido-CapCell Pak C18 UG120, 250×10 mm, UV 220 nm, CH3CN gradient 20-100%, flow 1.5 ml/min)을 통해 정제한 후, 분자량과 1H-NMR data로부터 본 연구팀이 보고한바 있는 선행 문헌8)과 비교를 통해 (3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylic acid 1-(3,4- dihydroxyphenyl)-2-methoxycarbonylethyl ester (5.8 mg) (C19H18O8; MW 374)로 동정되었다(Fig. 1).
- − 항바이러스 화합물을 찾기 위해서 CVB4에 대한 항바이러스 효과를 HeLa cell의 생존율 분석을 통해 검증하였다.
- 바이러스 역가는 이전의 논문에서 기술한 바와 같이 HeLa cell에서 plague forming unit(PFU) assay를 통해 결정하여 실험에 사용하였다.10) 요약하면, 바이러스 감염 세포 상등액을 준비하고 6-well plate에 배양된 HeLa 세포에 30분간 감염시킨 후 3% Difco agar/DMEM을 3 mm로 덮고 37℃ CO2 배양기에서 이틀간 배양하여 plaque forming unit(PFU) assay로 바이러스 역가를 측정하였다. HeLa cell은 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)에서 배양하였다.
- 1 mM 농도로 ORI2를 처리하였다. 18시간이 지난 후, 전체 단백질을 추출하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, CVB4의 막 단백질 VP1은 ORI2의 투여농도에 따라 유의한 감소를 나타내었다(Fig.
- 7) 간단히 요약하여, HeLa cell을 104 PFU/ml로 CVB4를 30분간 감염시키고 5% FBS DMEM에 순차적으로 희석한 화합물을 처리하였다. 18시간 감염 후, 세포 증식 검출시약인 Cell Counting Kit 8(CCK-8) 7 µl를 넣고 2시간 동안 더 배양하였다.
- − ORI2의 CVB4 증식을 배양세포 상등액의 생바이러스 농도를 PFU assay를 통해 확인하였다. CVB4 감염 후 OIR2를 처리하여 배양한 세포의 배양액을 얻어 HeLa cell에 처리하고 PFU assay를 수행하여 생바이러스의 농도를 측정하였다. 결과에서 보여주는 것과 같이 ORI2의 처리는 농도에 따라 강력하게 CVB4의 복제와 증식을 억제하였다(Fig.
- 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였고, 성분 분리를 위한 순상 column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 물질분리 및 확인에 사용한 TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC는 Hitachi사(Japan)의 기기를 통하여 측정하였고, column은 Shisheido사의 CAPCELL PAK C18(250×10 mm, Japan)를 이용하였다. Mass 스펙트럼은 ESI-MS(electro spray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였고, 1H-NMR은 Varian UNITY 300(USA)기기로 CD3OD 용매를 이용하여 측정하였다.
- 18시간 감염 후, 세포 증식 검출시약인 Cell Counting Kit 8(CCK-8) 7 µl를 넣고 2시간 동안 더 배양하였다. Microplate reader(Molecular device, USA) 를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존을 확인하여 항바이러스 효능을 확인하였다.
- − Coxsakievirus B4는 America Tissue Culture Collection (ATCC)의 기준 바이러스의 혈청형을 구입하여 사용하였다. 바이러스 역가는 이전의 논문에서 기술한 바와 같이 HeLa cell에서 plague forming unit(PFU) assay를 통해 결정하여 실험에 사용하였다.10) 요약하면, 바이러스 감염 세포 상등액을 준비하고 6-well plate에 배양된 HeLa 세포에 30분간 감염시킨 후 3% Difco agar/DMEM을 3 mm로 덮고 37℃ CO2 배양기에서 이틀간 배양하여 plaque forming unit(PFU) assay로 바이러스 역가를 측정하였다.
- 본 연구팀은 몇몇 후보 화합물을 확보하였고, 그들의 항바이러스 활성을 평가하였다. 오리방풀 추출물로부터 분리된 ORI2는 이전 연구에서 항 세포 사멸 효과를 보여주었다.
- 연구에서는 오리방풀(Isodon excisus)로부터 분리한 페닐프로파노이드계 ORI2 화합물의 CVB4에 대한 항바이러스 효과를 측정하였으며, ORI2의 CVB4에 대한 유전자 복제와 바이러스 증식억제 효과를 세포 실험을 통해 확인하였다. 향후 CVB4에 의해 유도된 췌장염 동물 모델에서 그 실제 효능을 연구해야 할 것으로 사료되며, 이번 항바이러스 결과를 통해 볼 때 ORI2가 장내바이러스 췌장염의 치료약물로서 개발 될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이때 바이러스의 positive 가닥 증폭을 위해 VP1-antisense primer(5'-CACCGGATGGCCAATCCA-3')로 먼저 RT 반응을 수행하여 cDNA를 생산하고 생산된 cDNA를 주 형으로 VP1-AS와 VP1-sense primer(5'-GCGAAGAGTCT ATTGAGCTA-3')를 사용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 수행하고 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 확인하였다.
- 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였고, 성분 분리를 위한 순상 column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 물질분리 및 확인에 사용한 TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC는 Hitachi사(Japan)의 기기를 통하여 측정하였고, column은 Shisheido사의 CAPCELL PAK C18(250×10 mm, Japan)를 이용하였다.
대상 데이터
- − Coxsakievirus B4는 America Tissue Culture Collection (ATCC)의 기준 바이러스의 혈청형을 구입하여 사용하였다.
- − 본 실험에 사용된 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo)은 2012년 8월경 지리산 일원에서 채집한 후 건조하여 사용하였으며, 한국인삼연구소 이상명 박사가 동정하였고, 표본은 대구한의대학교 표본실에 보관하였다.
- − 세포배양에 사용된 DMEM 배지, fetal bovine serum(FBS)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였다.
- HeLa cell은 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)에서 배양하였다. HeLa-UVM cell은 삼성서울병원(전은석 교수)에서 분양 받았다.11)
- − 세포배양에 사용된 DMEM 배지, fetal bovine serum(FBS)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였다. Tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였고, 성분 분리를 위한 순상 column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 물질분리 및 확인에 사용한 TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC는 Hitachi사(Japan)의 기기를 통하여 측정하였고, column은 Shisheido사의 CAPCELL PAK C18(250×10 mm, Japan)를 이용하였다.
- 이러한 결과들은 바이러스 복제를 억제하는 것이 장내바이러스 치료에 효과적인 방법이 될 수 있다는 것을 시사한다. 새로운 장내바이러스 억제제를 개발하기 위해 천연 화합물 중 장내바이러스 복제를 억제하는 물질을 HeLa 세포를 사용하여 선별 하였으며 이중 췌장염의 원인 바이러스로 생각되는 CVB4에 항바이러스 효과를 보이는 천연물을 선택하였다.2)
데이터처리
- − 모든 결과는 mean±SEM으로 나타냈다. Control과 바이러스 감염 그룹 간의 결과는 Mann-Whitney nonparametric t-test(GraphPad Prism 3.0 for Windows; GraphPad Software, La Jolla, USA)를 이용하였다. 통계적 유의성은 P<0.
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