동결 닭 PGCs의 생식계열키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 PGCs의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존 세포를 확보하는 것과, 생식계열 키메라의 제작 효율을 높이는 것이 반드시 필요하다. 닭 PGCs는 배양 5.5~6일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 PGCs를 분리했다. 15% 각각의 EG와 DMSO를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종(A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.
동결 닭 PGCs의 생식계열 키메라를 이용한 생체에의 복원을 실용화 하기 위해서는, 닭 PGCs의 동결 보존 기술의 향상에 의해 동결 및 융해 후의 많은 생존 세포를 확보하는 것과, 생식계열 키메라의 제작 효율을 높이는 것이 반드시 필요하다. 닭 PGCs는 배양 5.5~6일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 PGCs를 분리했다. 15% 각각의 EG와 DMSO를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종(A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.
This study was conducted to establish the method for preserving chicken primordial germ cells (PGCs) that enables long-term storage in liquid nitrogen ($LN_2$) for developmental engineering or preservation of species. The purpose of this study is to clarify the effects of simple freeze-th...
This study was conducted to establish the method for preserving chicken primordial germ cells (PGCs) that enables long-term storage in liquid nitrogen ($LN_2$) for developmental engineering or preservation of species. The purpose of this study is to clarify the effects of simple freeze-thaw treatment on viability of PGCs in chickens and to the optimal protocol for PGCs freezing. PGCs obtained from the germinal gonade of an early embryos of 5.5~6 day (stage 28) of Isa Brown, Korean Ogye (KO), White Leghorn and Commercial breeds, using the MACS method were suspended in a freezing medium containing a freezing and protecting agents (e.g. dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and propylene glycol (PG)). The gonadal cells, including PGCs, were then frozen in 1 of the following cryoprotectant treatments : 2.5%, 5%, 10%, 15%, and 0% cryoprotectant (DMSO, EG, PG) as a control. Effects of exposure to simple freezing, with different concentrations of the cryoprotectant solution, were examined. After simple freezing, the viability of PGCs after freeze-thawing was significantly higher for Commercial breeds ($88.7{\pm}2.4%$) than KO ($85.1{\pm}0.4%$), Isa Brown ($84.6{\pm}0.2%$) and White Leghorn ($85.9{\pm}0.1%$) (p<0.05) using 10% EG cryoprotectant. Therefore, these systems may contribute in the improvement of cryopreservation for a scarce species in birds preservation. This study established a method for preserving chicken PGCs that enables systematic storage and labeling of cryopreserved PGCs in liquid ($LN_2$) at a germplasm repository and ease of entry into a database.
This study was conducted to establish the method for preserving chicken primordial germ cells (PGCs) that enables long-term storage in liquid nitrogen ($LN_2$) for developmental engineering or preservation of species. The purpose of this study is to clarify the effects of simple freeze-thaw treatment on viability of PGCs in chickens and to the optimal protocol for PGCs freezing. PGCs obtained from the germinal gonade of an early embryos of 5.5~6 day (stage 28) of Isa Brown, Korean Ogye (KO), White Leghorn and Commercial breeds, using the MACS method were suspended in a freezing medium containing a freezing and protecting agents (e.g. dimethyl sulfoxide (DMSO), ethylene glycol (EG) and propylene glycol (PG)). The gonadal cells, including PGCs, were then frozen in 1 of the following cryoprotectant treatments : 2.5%, 5%, 10%, 15%, and 0% cryoprotectant (DMSO, EG, PG) as a control. Effects of exposure to simple freezing, with different concentrations of the cryoprotectant solution, were examined. After simple freezing, the viability of PGCs after freeze-thawing was significantly higher for Commercial breeds ($88.7{\pm}2.4%$) than KO ($85.1{\pm}0.4%$), Isa Brown ($84.6{\pm}0.2%$) and White Leghorn ($85.9{\pm}0.1%$) (p<0.05) using 10% EG cryoprotectant. Therefore, these systems may contribute in the improvement of cryopreservation for a scarce species in birds preservation. This study established a method for preserving chicken PGCs that enables systematic storage and labeling of cryopreserved PGCs in liquid ($LN_2$) at a germplasm repository and ease of entry into a database.
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문제 정의
그러므로 원시 생식 세포의 대량 확보 수단으로서의 원시 생식 세포의 동결 보존 기술 개발이 시급히 요구되고 있는 실정이다. 그러므로 닭 PGCs의 동결에 관한 기초 자료를 얻기 위하여 본 연구는 생식계열 키메라 제작에 앞서, 먼저 오계를 필두로 이사 브라운종, 화이트 레그혼종 그리고 상업용 닭의 네 품종의 닭 PGCs 간이 동결 방법에 의한 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율의 향상에 초점을 맞추고, 혈청이 미치는 영향에 대해서 비교 및 검토하였다.
, 1984). 본 연구에서는 투과성 (EG, DMSO, PG) 및 비 투과성 억제제인 혈청알부민(serum albumin), 혈청(serum)을 가지고, 간이 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율에 관한 검토를 실시하였다. 그 결과, Kim 등 (2013)이 유리화 방법을 이용해 닭 원시 생식 세포를 동결 및 융해 후의 생존율 비교 연구의 결과와 유사했다.
특히, 닭 PGCs의 유리화 동결 방법과 완만 동결의 비교 검토로 동결 보존 기술이 증진된다면, 조류의 유전자원 보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진될 것으로 판단된다. 우선, 본 연구에서는 동결 보존 기술의 개선에 의한 한국 재래닭 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 높이기 위해서, 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 검토하였으며, 동결 방법의 개선을 목적으로 간이 동결법을 이용한 닭 품종 간의 원시 생식 세포의 동결 성적을 비교 및 검토하였다.
더욱이 닭 PGCs의 배양체계는 아직까지 완전하게 확립되어 있지 않은 영역이라, 성공적인 닭 PGCs의 동결 보존은 유전자원 보존으로서 필수적인 기술로 추정된다. 일반적으로 닭 PGCs의 정제 방법과 이식 방법에 의한 생식 계열 키메라 제작에 관한 연구 결과를 많은 연구자들이 보고(Natio et al., 1994; Kino et al., 1997; Han et al., 2002; Petitte et al., 2006)하고 있으나, 닭 PGCs의 동결 방법에 관한 직접적인 비교 및 검토는 미진하다고 판단되었기에, 본 연구에서 닭 PGCs의 동결 효율성을 증진시키는 방법에 관한 연구를 실시하였다. 특히, 닭 PGCs의 유리화 동결 방법과 완만 동결의 비교 검토로 동결 보존 기술이 증진된다면, 조류의 유전자원 보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진될 것으로 판단된다.
제안 방법
5% 소혈청알부민(Sigma)을 첨가한 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (D-PBS, Sigma)를 사용하였다. 15% FBS를기초로EG, DMSO 및 PG를 0%(대조군), 2.5% 5%, 10% 그리고 15%를 첨가한 동결 배지의 농도 조건으로 오계의 gPGCs를 동결 및 융해를 실시하였다. 0.
큰 세포 다발 그리고 분해되지 않은 조직의 단편들을 제거하기 위해서 세포 부유액은 20 μm 격자 크기의 망 구조 필터(BD falcon, Cell Strainer, USA)를 이용하여 필터를 하고, 200 g에 5분간 원심 분리를 했다. MiniMACS(magnetic-activated cell sorting) system(Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)을 이용해서 원시 생식선 유래의 닭 PGCs(gPGCs)를 순수 분리 및 정제하였다(Kim et al., 2004). 원심분리 후, 생식선 세포 (한 개의 tube당 3×106∼5×106)는 SSEA-1 항체를 이용하여 MACS 방법으로 순수 gPGCs를 정제하였다.
그리고 각 군의 원시 생식 세포 수는 약 250∼350개 정도로 조절하고, 동결 용기는 동결용 튜브 그리고 동결 방법은 스티로폼 박스를 이용한 간이 동결법을 이용하고, 동결 및 융해 후의 원시 생식 세포 생존율 측정은 0.4% Trypan blue 염색법(Freshney, 2005)을 이용해 서로 비교 검토하였다.
동결 배지의 기초가 되는 혈청으로서 소태아 혈청(FBS)를 기초로 하고, 동결 보호제로서 DMSO, EG 그리고 PG의 세 가지를 각각 사용하였다. 그리고 원시 생식 세포에 대해서, 0(대조군), 2.5, 5, 10, 15%를 첨가한 동결용 배지와 동결용 배지의 기초가 되는 혈청으로써 15% FBS를 기초로 하였다. 그리고 각 군의 원시 생식 세포 수는 약 250∼350개 정도로 조절하고, 동결 용기는 동결용 튜브 그리고 동결 방법은 스티로폼 박스를 이용한 간이 동결법을 이용하고, 동결 및 융해 후의 원시 생식 세포 생존율 측정은 0.
닭 PGCs의 형태학적인 특징 중의 하나인 일반 세포에 비해 부피가 크고, 더불어 수분 함유량이 비교적 많아, 이를 효과적으로 동결 보존하기 위해서는 특히, 얼음 결정의 형성 (Sutton et al., 1991; Gardner et al., 2000)을 근본적으로 피할 수 있는 유리화 동결법을 검토하였다. 이 방법은 세포를 급속히 동결시키고, 동결 용액의 점성을 증가시켜 세포 내·외의 유리수가 비결정형으로 유지되는 동결법(Hey and Mar-Farlane, 1996)이다.
닭 생식선 유래 세포 혼합물을 PGC-specific antibody로 알려진 anti-stage specific embryo antigen(anti-SSEA)-1 antibody(Santa Cruz Biotechnology, mouse IgM isotype: SSEA-1, MC-480)를 5% NGS/PBS에 1:200으로 희석하여 실온 20∼25℃에서 20분간 반응을 시켰다.
닭 원시 생식 세포를 동결할 때의 동결 용기는 0.25 mL 동결용 플라스틱 스트로(EcoStraw transparent, FHK, Japan), 0.5 mL 동결용 플라스틱 스트로(EcoStraw transparent, FHK, Japan) 그리고 동결용 튜브를 각각 이용해, 동결 및 융해 후의 원시 생식 세포 생존율을 통해 동결 용기별 최적의 효율을 비교 및 검토하였다.
닭의 원시 생식 세포를 동결할 때의 동결 배지의 기초가 되는 혈청으로 15% FBS를 기본으로 하고, 동결 보호제는 DMSO, EG 그리고 PG의 농도를 0(대조군), 2.5, 5, 10 그리고 15%로 되게 조정한 실험구를 설정한 후 동결 및 융해 후의 원시 생식 세포의 생존율을 통해 동결 배지의 농도별 최적의 효율을 비교 및 검토하였다.
동결 보존용기로서 동결용 플라스틱 스트로(0.25, 0.5 mL) 및 동결용 튜브를 이용, 간이 동결 방법을 이용한 동결 및 융해 후의 닭 원시 생식 세포의 세포 생존율을 확인하기 위하여 먼저 초기 배자의 발생 stages 28단계에서 채취한 닭 원시 생식 세포를 MACS 방법을 이용한 순수 분리 및 정제 전-후의 닭 원시 생식 세포의 형태학적인 특징을 Alkaline phosphatase(AP)와 Periodic acid-Schiff Staining(PAS)를 염색한 결과를 각각 Fig. 1 (A), (B)에 나타내었다. 그리고 순수 분리 정제 효율을 Fig.
발생 초기 배자로부터 원시 생식선의 분리 방법은 5.5일(stage 28(Hamburger and Hamilton, 1951))동안 발생한 초기 배자를 Mg2+와 Ca2+가 함유되지 않은 PBS (PBS(—), Sigma, St. Louis, MO, USA)가 담긴 큰 배양접시에 옮긴 후, 실체 현미경(SZH : Tokyo, Japan) 하에서 예리한 핀셋을 이용하여 원시 생식선 부분만을 분리한 후, MACS 법에 의해 분리 및 순수 정제를 하기 위해, 이를 1.5 mL 튜브에 수집하여 실온에 두었다.
세포는 125 μL의 10% FBS+DMEM에 부유시켜, CO2 배양기(5% CO2, 38℃)에서 3시간 배양한 후에 20 μL를 취한 후 0.4% trypan blue로 염색하여 trypan blue exclusion 방법에 의거하여 생존율을 검토하였으며(Freshney, 2005), 모든 간이 동결 실험은 8회에 걸친 반복테스트를 실시하였다.
세포를 부유시켜 15 mL 원심 분리용 시험관으로 옮겨서 DMSO, EG 및 PG의 희석 제거를 위해서 15% FBS+DMEM를 30초 간격으로 100 μL, 100 μL, 100 μL, 200 μL, 1,000 μL 그리고 8 mL를 넣고 각각 240 g에서 6분 간 원심 분리를 하여 상층액과 함께 동결 보호제를 제거하였다.
아래에 침전된 세포괴를 rat anti-mouse IgM microbeads 20 μL가 포함된 100 μL MACS buffer와 천천히 혼합하여 4℃에 15분 간 반응하고, 처리된 세포들은 조심스럽게 500 μL buffer를 첨가해 동일한 방법으로 세정을 한 후 MACS 컬럼을 이용하여 정제하였다(Kim et al., 2004).
최소한 1∼2달 후에 액체질소(LN2) 탱크로부터 동결 보존된 동결용 튜브를 꺼내어 공기 중에서 약 5초 간 상온에 유지하고, 37℃ 온탕에 3분 간 침지하여 융해를 실시하였다.
대상 데이터
그리고 남원시 소재의 일반양계농가의 44∼46 주령의 한국 육종협회3호종(상업용 닭 : C)의 수정란을 공급받아서 시험에 공시했다.
, 1995). 기존에는 독성이 강하고 점성이 높은 침투성의 동결 보호제로서 DMSO, glycerol 그리고 propandiol(1,2-PROH)를 사용하였다. 그러나 최근에는 Martino 등(1996)은 소 성숙 난자를 ethylene glycol을 사용하여 높은 배반포 발생효율을 보고한 것과 같이 ethylene glycol을 사용하는 빈도가 점차 높아지고 있으며, 비침투성 동결 보호제로는 dextran, raffinose, 난황, 혈청 알부민이 있으나, glucose와 sucrose를 가장 많이 사용하고 있다(Zhu et al.
닭 PGCs는 배양 5.5∼6일령의 닭 원시 생식선으로부터 채취하고, MACS 방법에 의해서 순수 닭 PGCs를 분리했다.
동결 배지의 기초가 되는 혈청으로서 소태아 혈청(FBS)를 기초로 하고, 동결 보호제로서 DMSO, EG 그리고 PG의 세 가지를 각각 사용하였다. 그리고 원시 생식 세포에 대해서, 0(대조군), 2.
본 실험에 사용된 공시계는 국립축산과학원에서 생산된 종란을 인수하여 부화시킨 한국재래닭 3원 교잡종과 가축유전자원시험장에서 보유하고 있는 44주령의 한국재래닭 오계(KO), 화이트레그혼(WL), 이사 브라운(IB)의 수탉에서 정액을 각각 채취하고, 같은 주령의 암탉에 대하여 인공수정을 실시하여 생산된 수정란을 1일에서 21일까지 10∼13°C, 습도 70∼85%의 종란 보관용 배양기에서 보관한 뒤 부화기에 입란하고, 5.5∼6일령의 발생란을 시료로 사용하였다.
본 실험은 국립축산과학원 가축유전자원시험장에서 사육 중인 실험 축을 사용하여 Hamburger and Hamilton(1951)의 배 발달 단계에 기초하여, 37.8°C, 상대습도 60∼70%인 부화기에서 배양하였다.
데이터처리
본 시험의 성적은 SAS package program(2000)을 이용하여 분산 분석을 실시하였으며, 처리 간의 유의성 검정은 Duncan’s multiple range test를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
원심분리 후, 생식선 세포 (한 개의 tube당 3×106∼5×106)는 SSEA-1 항체를 이용하여 MACS 방법으로 순수 gPGCs를 정제하였다.
Tajima 등(1998)은 또한, 발생 5일째 배자부터 동결 보존된 닭 원시 생식선유래닭 PGCs를 이용하여 생식선 유래 키메라를 제작하였다. 이러한 연구들 모두는 완만 동결(slow-freezing)법을 사용하였다(Naito et al., 1994; Tajima et al., 1998). 그러므로 조류 유전자원의 복원은 세포 동결 보존에 의하여 양쪽의 성염색체를 동시에 영구 보존할 수 있는 유일한 기술이라고 할 수 있으나, 아직까지 많은 기술적 어려움이 존재한다.
성능/효과
2에 나타내었다. 10% DMSO, EG 그리고 PG의 처리구가 나머지 2.5%, 5%, 15%의 처리구보다 원시 생식 세포의 생존율이 네 품종에 상관없이 높음을 확인했다. 또한, 네 품종에 있어 동결 보호제 10% EG와 10% DMSO 처리구 간에는 유의적(p<0.
15% 각각의 EG와 DMSO를 동결 보호제로 사용한 처리군이 각 군의 농도에 상관없이 유의적(p<0.05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다.
70%)임을 확인하였다. MACS 정제 후의 닭 원시 생식 세포의 생존비율은 아사 브라운종(91.11%), 오계종 (90.16%), 한국육종협회3호종(96.16%) 그리고 화이트 레그혼종(91.36%)의 순수 정제율을 각각 나타내었다. 상업용 닭으로 개량된 한국육종협회3호종에서 PGCs의 정제율이 가장 높았으나, 네 품종 간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다.
05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.
상업용 닭으로 개량된 한국육종협회3호종에서 PGCs의 정제율이 가장 높았으나, 네 품종 간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다. 네 품종에 관계없이 평균 90.94%의 정제효율을 확인했다.
1 (D)에 각각 나타내었다. 닭 원시 생식세포의 동결 및 융해 후의 원시 생식 세포의 순도는 MACS 정제 전, 살아있는 체세포의 비율이 이사 브라운종(96.0%), 오계종(95.14%), 한국육종협회3호종(96.15%) 그리고 화이트 레그혼종(96.70%)임을 확인하였다. MACS 정제 후의 닭 원시 생식 세포의 생존비율은 아사 브라운종(91.
11%의 유의적으로 더 높은 원시 생식 세포의 세포 생존률을 보였다. 동결용 튜브 처리군의 경우, 원시 생식 세포의 세포 생존률이 69.12%로 동결용 플라스틱 스트로 처리군과 비교해서 낮음을 확인하였고, 본 연구에서의 간이 동결 및 융해 실험을 수행하는데 있어서 가장 효율적인 동결 용기는 0.5 mL 동결용 플라스틱 스트로임을 확인하였다. 또한, 한국 재래닭으로 잘 알려져 있는 오계를 필두로 네 품종 간의 간이 동결 및 융해 후의 사용 동결 용기별 원시 생식 세포의 생존률은 비슷한 경향을 보였고, 네 품종 간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다.
또한 이번 실험 결과들로부터 닭 PGCs를 유전자원으로 영구 보존하기 위하여 0.5 mL 동결용 플라스틱 스트로 사용 시, 동결용 튜브보다 동결 및 융해 후의 세포 생존성이 유의적(p<0.05)으로 높은 수치를 나타내었다.
또한, 네 품종에 있어 동결 보호제 10% EG와 10% DMSO 처리구 간에는 유의적(p<0.05)인 차이는 보이지 않았지만, 10% PG 처리구에 비해 세포생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인했다.
5 mL 동결용 플라스틱 스트로임을 확인하였다. 또한, 한국 재래닭으로 잘 알려져 있는 오계를 필두로 네 품종 간의 간이 동결 및 융해 후의 사용 동결 용기별 원시 생식 세포의 생존률은 비슷한 경향을 보였고, 네 품종 간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다.
05)으로 더 높은 생존율을 보였다고 보고했다. 본 연구의 결과와 상반 되는 결과로, 이는 오히려 동결용 플라스틱 스트로 용기의 얇은 벽에 의하여 닭 PGCs의 동결 과정과 동결 후 보존 과정 및 융해 시의 온도 변화에 따른 충격 등과 같은 환경적인 요인 등으로 인하여 닭 PGCs가 많은 손상을 입었을 가능성도 배제할 수가 없다.
36%)의 순수 정제율을 각각 나타내었다. 상업용 닭으로 개량된 한국육종협회3호종에서 PGCs의 정제율이 가장 높았으나, 네 품종 간에는 유의적인 차이는 보이지 않았다. 네 품종에 관계없이 평균 90.
실험 1에서 최적의 농도별 효율을 확인한 후, 한국재래닭인 오계와 화이트레그혼종, 이사 브라운종 그리고 상업용으로 육종화된 한국육종협회3호종 네 품종 간의 동결 및 융해 후의 닭 원시 생식 세포의 생존율을 각각 확인했다.
그 결과, Kim 등 (2013)이 유리화 방법을 이용해 닭 원시 생식 세포를 동결 및 융해 후의 생존율 비교 연구의 결과와 유사했다. 즉, 간이 동결 시, 동결 보호제로 EG, DMSO 그리고 PG를 각각 0 (대조군), 2.5, 5, 10, 15%의 비교적 낮은 농도를 사용했고, 특히 10% EG+15% FBS 조합의 처리군의 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 가장 높았다. 이는 Friedler 등(1988)이 세포 내로의 침투 속도가 DMSO의 경우, 20∼30분이며, glycerol은 거의 60분 이상으로 매우 느린 것에 반해서, 분자량이 비교적 작고 세포막 투과성이 다른 동결 보호제에 비해 뛰어난 특성을 가진, EG의 경우, 5∼7분으로 가장 빠르다는 보고로부터 혹시, 빠른 침투에 의한 삼투압 평형에 도달한 결과, 삼투압 충격의 최소화 등에 기인해서 10% EG 처리군에서 닭 PGCs에 미치는 손상을 최소화 했을 가능성이 사료된다.
특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종 (A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 원시 생식 세포의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 Fig. 2 (E) 에서 확인하였다.
05)으로 PG 처리군보다 동결 및 융해 후의 세포의 생존율이 높음을 확인하였다. 특히, 10% EG+FBS 조합의 처리군에서 상업용 닭인 한협육종협회3호종(B : 88.7%)이 오계종(A : 85.1%), 아사 브라운종(C : 84.6%) 그리고 화이트 레그혼종(D : 85.9%)의 세 품종보다 동결 및 융해 후의 닭 PGCs의 생존율이 유의적(p<0.05)으로 높음을 확인하였다. 간이 동결에 있어서 가장 높은 생존율을 보인 10% EG이 10% DMSO와 함께 최적의 동결 보호제로서 사용 가능성을 확인하였다.
후속연구
, 2006)하고 있으나, 닭 PGCs의 동결 방법에 관한 직접적인 비교 및 검토는 미진하다고 판단되었기에, 본 연구에서 닭 PGCs의 동결 효율성을 증진시키는 방법에 관한 연구를 실시하였다. 특히, 닭 PGCs의 유리화 동결 방법과 완만 동결의 비교 검토로 동결 보존 기술이 증진된다면, 조류의 유전자원 보존의 복원과 함께 형질전환 닭의 보존 방법에 관한 효율성이 증진될 것으로 판단된다. 우선, 본 연구에서는 동결 보존 기술의 개선에 의한 한국 재래닭 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 높이기 위해서, 오계 PGCs의 동결 및 융해 후의 생존율을 검토하였으며, 동결 방법의 개선을 목적으로 간이 동결법을 이용한 닭 품종 간의 원시 생식 세포의 동결 성적을 비교 및 검토하였다.
실험동물 중에서 가장 많이 이용되는 대표적인 포유류인 마우스의 배아와 조류인 닭 PGCs의 유리화 동결 연구 결과를 직접적으로 서로 비교 및 해석하는 것은 불가능하다. 하지만, 차후에 닭 PGCs 동결 보호제의 종류와 처리시간을 조절하여 세포 독성을 줄이는 방법의 확립과 이를 통해 닭 PGCs 내 투과 속도가 높고 독성이 적은 동결 보호제를 도입하거나, 투과성과 비 투과성 동결 보호제를 조합하여 상대적인 농도 변화 없이 절대적인 농도를 낮추는 방법을 통해서 최종적으로 닭 PGCs에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후, 동결 효율을 증진시키는 방법 개발 등에 관해서 좀 더 구체적으로 검토해야 할 필요성이 있다.
만약, 동결된 닭 PGCs를 장기간 보존할 수 있고, 동결 후 높은 생존율과 조직 특이적인 다양한 계통으로 분화가 가능하다면, 동결 닭 PGCs의 생식계열 키메라를 이용한 한국 재래닭인 오계를 필두로 멸실 위기의 계통과 개체의 복원이 실용화될 가능성이 높아지게 된다. 향후, 닭 PGCs의 동결 보존은 형질전환 닭의 생산에 있어서 닭 PGCs의 유전자 도입 실험의 설계를 용이하게 계획하기 위하여 필수적인 기술로 추정되고, 기존의 생산된 형질전환 닭의 유전자원 보존을 위하여 형질전환 개체의 후대 종란의 PGCs를 보존하는 방안에서도 이용될 가능성이 높다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
조류가 멸종위험에 처한 이유 중 하나인 전염병의 명은?
0%에 해당하는 1,313종이 멸종위험에 처한 것으로 분류되어 보고되었다(IUCN, 2012). 이는 이미 가금류들 중에 일부가 멸종 위험에 처해 있고(Fulton & Delany, 2003), Blackburn( 2006)은 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI)와 같은 치명적이고 잠재적인 전염병 등으로부터 가금산업 전반적으로 위기에 직면해 있다고 보고했다. 가축유전자원의 보존 및 관리는 여러 국제기구에서 쟁점화 되고 있는데, 특히 CBD (Convention on Biological Diversity : 생물다양성협약) 가축의 유전적 다양성 보존은 지속 가능한 축산업 발전에 필수적인 요소이다.
척추동물 중 가장 많은 비율을 차지하는 종은?
사람을 포함한 척추동물 종의 개수가 64,283개인데, 그 중에서 조류가 10,064개 비율로 가장 많이 차지한다(International Union for Conservation of Nature and Natural Resources (IUCN))고 2012년도 보고서에 제시를 했다(IUCN, 2012). 이와 같이 조류 종의 중요한 특징 중의 하나는 유전적인 다양성이 상당히 높다는 것이다.
동결 보존의 기본 원리는?
동결 보존의 기본 원리는 세포의 고유한 형태를 유지하면서 내부의 수분을 고농도의 동결 보호제(cryoprotectant)의 삼투압 원리를 이용하여 점진적으로 제거하고, 이로 인해 얼음 결정(icecrystal)을 최소화하여 세포를 보호하는 것이다(Yoon et al., 2007).
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