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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 고농도의 염분을 함유한 폐수의 정화능이 우수한 기능성 커뮤니티를 확보하고, 확보된 커뮤니티를 구성하는 미생물의 다양성을 확인하여 고농도 염분폐수 기능성 미생물 커뮤니티의 유용성을 밝히기 위해 연구하였다. 또한, 고농도의 염분으로 오염된 시료에서 확보한 미생물 커뮤니티의 우점 미생물들을 동정하여 계통학적으로 분석하고, 고농도 염분을 함유한 폐수의 정화율을 분석하여 기능성 미생물 커뮤니티의 유용성을 확인하였다.
제안 방법
- 미생물 다양성을 확인하기 위하여 시료로부터 얻은 DNA를 주형으로 1차 PCR과 nested-PCR 반응을 수행하였다. DGGE 분석을 위하여, 1차 PCR의 증폭산물을 주형으로 2차 PCR을 수행하였으며, 16S rDNA를 증폭하기 위하여 사용된 primer는 40개의 GC-clamp가 붙은 341F-GC (5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)와 786R (5′-CTA CCA GGG TAT CTA ATC-3′)을 이용하였다 [6, 7]. 2차 PCR을 위한 PCR mixture는 1차 PCR에 사용된 것과 동일하며, 사용된 PCR 반응조건은 94℃에서 5 min 동안 DNA를 변성시켜, 94℃에서 45 sec denaturation, 60℃에서 45 sec annealing, 72℃에서 45 sec extension하고 72℃에서 7 min 동안 final extension을 수행하였다.
- 이에 본 연구에서는 고농도의 염분을 함유한 폐수의 정화능이 우수한 기능성 커뮤니티를 확보하고, 확보된 커뮤니티를 구성하는 미생물의 다양성을 확인하여 고농도 염분폐수 기능성 미생물 커뮤니티의 유용성을 밝히기 위해 연구하였다. 또한, 고농도의 염분으로 오염된 시료에서 확보한 미생물 커뮤니티의 우점 미생물들을 동정하여 계통학적으로 분석하고, 고농도 염분을 함유한 폐수의 정화율을 분석하여 기능성 미생물 커뮤니티의 유용성을 확인하였다.
- 본 연구는 고농도의 염분을 함유하고 있는 폐수의 정화능이 우수한 기능성 미생물 커뮤니티(Hypersaline Wastewater Treatment Community; HWTC)를 집적배양을 통해 확보하였다. 또한, HWTC의 고농도의 염분을 함유하고 있는 폐수의 정화능 및 활성을 조사하고, HWTC 내의 미생물을 동정하여, 미생물 다양성과 미생물 커뮤니티의 유용성을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 폐수는 고농도의 염분을 함유하고 있는 K사의 epoxy 폐수로써 CODcr이 약 8,500 ppm, total chloride (Cl−) 9%, pH 12, total nitrogen (TN) 100 ppm, NH3-N 90 ppm, total phosphorus (TP) 3 ppm의 성상을 가지고 있다. 이외에도 아닐린이 약 300 ppm 정도 함유되어 있어서 실험시 Feed는 톨루엔을 이용하여 아닐린을 제거하였다.
- MLSS의 유지를 위하여 침전조에서 슬러지 반송량을 주입 Feed 량의 약 2배가 되게 하였고 운전기간 중 조내의 MLSS는 2,500-3,000 ppm되게 유지하였다. 본실험에 사용된 식종슬러지는 Q-biotech사의 고농도 생물학적 전처리장치(QBR)가 적용된 S사의 QBR 포기조 슬러지를 채취하여 순응시킨 후 약 1개월 이상 운전하였다.
데이터처리
- Cloning은 T-Blunt vector (Solgent, Daejeon, Korea)를 이용하였고, manufacturer’s protocol을 따라 수행하여 16S rRNA gene 의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)의 GenBank database를 이용하여 BLAST search를 통해 분석하였다[12].
이론/모형
- 4% 염분을 함유하는 폐수의 정화능이 우수한 HWTC의 미생물 다양성을 확인하기 위해 분자생물학적 기법을 이용하였다. 포기조내의 HWTC sludge로부터 DNA를 추출하여 박테리아용 universal primer로 알려진 341F-GC와 786R primer를 이용하여 PCR 증폭산물을 얻었고, agarose gel에서 예상했던 486 bp의 band를 확인하였다(자료 미제시).
- 45 μm 마이크로 여과지로 여과하여 COD를 측정하였다. COD 분석은 Standard method의 크롬법을 이용하여 분석하였다[2].
- Band에서 회수한 DNA를 주형으로 PCR에 사용한 primer를 이용하여 재증폭을 수행했으며, PCR 산물은 아가로스젤에서 전기영동하여 DNA recovery kit (QIAGEN, Germany)로 정제한 후 cloning 하였다. Cloning은 T-Blunt vector (Solgent, Daejeon, Korea)를 이용하였고, manufacturer’s protocol을 따라 수행하여 16S rRNA gene 의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI (www.
- PCR 산물은 DcodeTM System (Bio-Rad, USA)을 이용하여 DGGE를 수행하였다[23]. Denaturing gradient gel은 10% polyacrylamide (37.
- 포기조의 미생물 군집을 분석하기 위하여, 분자·생물학적 기법인 denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)를 이용하였다. 미생물 다양성을 확인하기 위하여 시료로부터 얻은 DNA를 주형으로 1차 PCR과 nested-PCR 반응을 수행하였다.
성능/효과
- 박테리아 universal primer인 27F와 1542R을 이용하여 PCR 증폭산물을 얻었으며, cloning을 통하여 염기서열을 분석하였고 NCBI blast를 검색하여 동정하였다. HWTC의 동정 결과 Paenibacillus (AY571847, 25%), Pseudidimarina (DQ118948, 19.4%)와 Idiomarina (DQ985070, 11.1%)가 우점을 나타내고 있다 (Table 2). 또한 Azospirillum (AF411851, 8.
- 기존의 폐수내 3% 이상의 염분을 함유할 경우 폐수의 정화가 불가능하다고 알려져 있다[1, 33]. 그러나, 본연구에서는 기존의 한계점 3% 염분)보다 높은 4%의 염분을 함유하는 폐수를 기능성 미생물 커뮤니티 HWTC의 확보 및 적용을 통하여, 한달간 수질 정화능을 확인한 결과 평균 84% (CODcr) 이상의 높은 처리효율을 확인하였다. 또한, 4% 염분을 함유한 폐수를 생분해하는 기능성 미생물 커뮤니티 HWTC를 확보 및 미생물 군집을 분석하여 우점하는 미생물을 확인한 결과, Paenibacillus sp.
- 그러나, 본연구에서는 기존의 한계점 3% 염분)보다 높은 4%의 염분을 함유하는 폐수를 기능성 미생물 커뮤니티 HWTC의 확보 및 적용을 통하여, 한달간 수질 정화능을 확인한 결과 평균 84% (CODcr) 이상의 높은 처리효율을 확인하였다. 또한, 4% 염분을 함유한 폐수를 생분해하는 기능성 미생물 커뮤니티 HWTC를 확보 및 미생물 군집을 분석하여 우점하는 미생물을 확인한 결과, Paenibacillus sp.가 25%로 우점하는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해서 신규성을 보유한 신규 미생물 커뮤니티의 자원화와 더불어, HWTC는 국내뿐만 아니라 국외의 고염폐수 및 고염환경의 생물정화(Bioremediation)에 기여할 것으로 기대된다.
- 8%) 등이 기타 군집을 이루고 있다. 미생물 군집분석을 통해 확인된 미생물중에 γ-proteobacteria (Alcanivorax, Arenimonas, Halomonas, Idiomarina, Marinobacter, Methylophaga, Pseudidiomarina)가 47.2%로 매우 높게 우점하는 것을 확인하였으며(Fig. 4), HWTC 내에 존재하는 γ-proteobacteria 들은 3% 이하의 염분을 함유한 폐수를 처리하는 슬러지의 미생물 커뮤니티에서도 발견되는 미생물들이다[18, 34].
- 본 연구에서 확보한 4%의 염분을 함유한 폐수의 정화능이 우수한 HWTC의 미생물 커뮤니티에는 γ-proteobacteria에 속하는 미생물이 다양성이 높다는 것을 알 수 있다. 그러나, HWTC의 미생물 커뮤니티에서 단일종으로는 firmicute 에 속하는 Paenibacillus sp.
- 5일 만에 유입 CODcr 약 5,000 ppm의 폐수를 800 ppm 정도로 84% 이상의 처리효율을 나타냈다. 이는 고농도로 염분을 함유하고 있는 폐수에서는 매우 높은 처리효율로서, 현재까지 3% 이상의 염분을 함유하고 있는 폐수정화는 처리가 매우 어렵다고 보고되어졌으나[33], 본 연구에서 확보한 HWTC는 기존의 보고와 달리 매우 높은 처리효율을 보이는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해서 고농도의 염분을 함유하고 있는 폐수의 처리에 있어서 기능성 미생물 커뮤니티인 HWTC의 폐수정화 능력이 매우 우수함을 확인하였으며, 1개월간의 지속적인 운전을 통해서 매우 높은 처리효율의 폐수정화능력이 안정되게 유지되는 것을 확인되었다.
- 이는 고농도로 염분을 함유하고 있는 폐수에서는 매우 높은 처리효율로서, 현재까지 3% 이상의 염분을 함유하고 있는 폐수정화는 처리가 매우 어렵다고 보고되어졌으나[33], 본 연구에서 확보한 HWTC는 기존의 보고와 달리 매우 높은 처리효율을 보이는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해서 고농도의 염분을 함유하고 있는 폐수의 처리에 있어서 기능성 미생물 커뮤니티인 HWTC의 폐수정화 능력이 매우 우수함을 확인하였으며, 1개월간의 지속적인 운전을 통해서 매우 높은 처리효율의 폐수정화능력이 안정되게 유지되는 것을 확인되었다. 또한, 반응조 운전 시작시 염분농도는 약 1.
후속연구
- 가 25%로 우점하는 것을 확인하였다. 본 연구결과를 통해서 신규성을 보유한 신규 미생물 커뮤니티의 자원화와 더불어, HWTC는 국내뿐만 아니라 국외의 고염폐수 및 고염환경의 생물정화(Bioremediation)에 기여할 것으로 기대된다.
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