[논문]Bacillus sp. SKU31-1가 생산하는 α-Glucosidase 저해제 분리 및 특성 조사

김신덕

doi:10.7845/kjm.2014.4081

Bacillus sp. SKU31-1가 생산하는 α-Glucosidase 저해제 분리 및 특성 조사
Isolation and Characterization of α-Glucosidase Inhibitor Produced by Bacillus sp. SKU31-1 Strain 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.50 no.4, 2014년, pp.381 - 383

초록
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미생물 기원의 ${\alpha}$-glucosidase 저해제를 탐색하는 과정에서 토양에서 분리한 균주인 Bacillus sp. SKU31-1 배양액에서 강력한 저해제 compound K을 일련의 크로마토그래피 방법에 의해 분리 정제하였고 $^1H$ NMR, $^{13}C$ NMR, $^1H-^1H$ COSY spectra 분석과 문헌조사를 통해 5-amino-1-hydroxymethyl-1,2,3,4-cyclohexanetetrol로 동정되었다. Compound K의 ${\alpha}$-glucosidase 저해 활성은 $IC_{50}$값이 maltose 기질에서는 $1.9{\mu}M$이고, sucrose 기질 사용시 4.9 mM이었다. Lineweaver Burk plot에 의해 $K_i$값이 0.15 mM 로 강력한 경쟁적 저해제 임이 밝혀졌다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the course of screening for ${\alpha}$-glucosidase inhibitor produced by microorganism, the active compound was isolated from the culture filtrate of Bacillus sp. SKU31-1 using a series of chromatography procedures. The structure of the active compound was elucidated as 5-amino-1-hydroxymethyl-1, 2, 3, 4-cyclohexanetetrol on the basis of spectroscopic evidence obtained and comparison with data from the literature. The active compound showed potent inhibitory activity against ${\alpha}$-glucosidase with an $IC_{50}$ value of $1.9{\mu}M$ for maltose and 4.9 mM for sucrose. A Lineweaver-Burk plot indicated that its inhibition of ${\alpha}$-glucosidase was competitive, with a $K_i$ value of 0.15 mM.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

분자식은 ESI-MS와 NMR data에 의해 C₇H₁₅NO₅으로 밝혀졌으며, (M+H)⁺ peak는 m/z 194에 나타났다. ¹³C NMR spectrum에서 7개의 signal (2 x methylene, 4 x methine 과 1 x quaternary carbon)을 확인할 수 있었으며, chemical shift는 ¹H-¹H 2D NMR spectra에 의해 결정하였다(Table 2). ¹H NMR spectrum에 의해 six-membered ring 구조와 side chain methylene 존재가 확인되었고, H-2의 doublet splitting으로 C-1 carbon이 proton을 가지고 있지 않음을 알 수 있었다.
Compound K의 구조는 EI-MS, ¹H NMR, ¹³C NMR, 2D COSY 등을 근거로 하여 결정하였다. 분자식은 ESI-MS와 NMR data에 의해 C₇H₁₅NO₅으로 밝혀졌으며, (M+H)⁺ peak는 m/z 194에 나타났다.
Phosphate buffer(25 mM, pH 6.8) 225 μl, 기질 (20 mM) 20 μl, 시료 25 μl, 효소(0.75 unit/ml) 15 μl를 혼합하여 37℃에서 20분간 반응시킨 뒤 NH4OH 500 μl를 첨가하여 반응을 종료시킨 후 micro plate reader를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하여 α-glucosidase 활성 억제 정도를 검정하였다.
Rat small intestinal α-glucosidase의 저해활성은 maltose (2 mM)와 sucrose (15 mM) 500 μl를 각각 기질로 하여 37℃에서 20분간 반응시킨 다음 100℃에서 5분간 처리하여 반응을 정지시킨 후 생성된 glucose 양을 glucose kit를 사용하여 측정하였다.
SKU31-1 균주의 활성 물질 생산을 위한 최적 배지조건을 확립하기 위해 G 배지, Tryptic Soy Broth (Bacto^TM), nutrient broth 배지에 각각 접종하여 230 rpm, 28℃에서 5일간 배양하며, 매 4시간 마다 pH 변화, 배지 종류와 배양 시간에 따른 균체 밀도와 활성을 측정하였다. 배지 종류에 따른 균체 성장의 차이는 나타나지 않고 사용한 모든 배지 조건에서 8시간 후 급격하게 증가하기 시작하여 배양 30시간 후 균체 밀도가 최대값(10⁹ CFU/ml)에 도달한 후 약간 감소 후 유지되었으나, α-glucosidase 저해 활성은 배지에 따라 큰 차이를 나타내었다.
미생물 기원의 α-glucosidase 저해제를 탐색하는 과정에서 토양에서 분리한 균주인 Bacillus sp. SKU31-1 배양액에서 강력한 저해제 compound K을 일련의 크로마토그래피 방법에 의해 분리 정제하였고 ¹H NMR, ¹³C NMR, ¹H-¹H COSY spectra 분석과 문헌조사를 통해 5-amino-1-hydroxymethyl-1,2,3,4-cyclohexanetetrol로 동정되었다. Compound K의 α-glucosidase 저해 활성은 IC₅₀ 값이 maltose 기질에서는 1.
본 연구에서는 국내 토양에서 분리한 균주 3,000주를 대상으로 α-glucosidase 저해제 생산 여부를 탐색한 결과 강력한 저해 활성을 보인 SKU31-1 균주를 선발하여 균주 동정 및 배양조건을 확립하였고, SKU31-1 균주가 생산하는 α-glucosidase 저해 물질(이하 compound K)를 분리하여 특성 조사를 실시하였다.
토양 시료 10 g을 2–3시간 정도 풍건하여 멸균수로 10-2, 10-3, 10-4로 희석한 후, nutrient agar 배지에 각각 200 µl씩을 도말하고 28℃에서 2일간 배양 후 나타난 single colony를 G 배지(soluble starch 1%, glucose 2%, soybean meal 2.5%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.2%, CaCO3 0.2%, pH 7.3)을 사용하여 28℃, 230 rpm으로 5일간 배양한 후 5,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 상등액의 효소 저해 활성을 검정한 결과 가장 강력한 저해 활성을 보인 균주 31-1을 선발하고 형태적, 배양적 특성 및 생화학적 특성 조사와 16S rDNA 염기서열 분석에 의한 균주 동정을 실시하였다.
활성물질 생산에 가장 효과적인 G 배지에서 SKU31-1 균주를 3일간 배양한 배양액(3 L)으로부터 여러 chromatography 방법들을 사용하여 활성물질을 분리하였다. 배양액을 5,000 rpm에서 30분간 원심분리 한 후 그 상등액을 Amberlite IRC-50 (H⁺, 3.

이론/모형

Compound K의 α-glucosidase (Yeast, Sigma) 저해 활성은 인공 기질인 p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside (Sigma)를 이용하여 분광법으로 검정하였다(Kim, 2013).

성능/효과

¹³C NMR spectrum에서 7개의 signal (2 x methylene, 4 x methine 과 1 x quaternary carbon)을 확인할 수 있었으며, chemical shift는 ¹H-¹H 2D NMR spectra에 의해 결정하였다(Table 2). ¹H NMR spectrum에 의해 six-membered ring 구조와 side chain methylene 존재가 확인되었고, H-2의 doublet splitting으로 C-1 carbon이 proton을 가지고 있지 않음을 알 수 있었다. 이상을 종합하고 문헌조사를 통해 활성 물질 K의 구조는 5-amino-1-hydroxymethyl-1,2,3,4-cyclohexanetetrol (Fig.
배지 종류에 따른 균체 성장의 차이는 나타나지 않고 사용한 모든 배지 조건에서 8시간 후 급격하게 증가하기 시작하여 배양 30시간 후 균체 밀도가 최대값(109 CFU/ml)에 도달한 후 약간 감소 후 유지되었으나, α-glucosidase 저해 활성은 배지에 따라 큰 차이를 나타내었다.
1). 이로서 SKU31-1 균주의 활성 물질 생산에 탄소원으로는 soluble starch, 질소원으로는 soybean meal이 효과적임을 알 수 있었다.
¹H NMR spectrum에 의해 six-membered ring 구조와 side chain methylene 존재가 확인되었고, H-2의 doublet splitting으로 C-1 carbon이 proton을 가지고 있지 않음을 알 수 있었다. 이상을 종합하고 문헌조사를 통해 활성 물질 K의 구조는 5-amino-1-hydroxymethyl-1,2,3,4-cyclohexanetetrol (Fig. 3)로 Streptomyces hygroscopicus에서 분리 보고된 바 있는 valiolamine (Kameda et al., 1984; Wang et al., 2010)과 동일한 물질임이 밝혀졌다. 그러나 Bacillus에서 violamine의 분리는 아직 보고된 바 없다.
Compound K는 시판 중인 α-glucosidase 저해제인 acarbose 보다 yeast α-glucosidase와 rat small intestinal maltase 활성은 약간 강하였으나 sucrase 활성은 현저히 낮게 나타났다. 효소와 pre-incubation 에 의해 compound K의 저해활성이 증가하여 효소와 천천히 반응하는 것을 알 수 있었고, 효소활성을 90% 저해하는 compound K 양을 효소와 혼합한 후 투석을 4시간씩 2회(USY-1 ultrafilter, Advantec MFS Inc) 실시하여 반응하지 않은 compound K을 제거하였을 때 효소활성이 복구되는 것으로 보아 compound K는 가역적 저해제임을알 수 있었다. Lineweaver-Burk plot에 의해 compound K가 competitive inhibitor임이 밝혀졌으며, Ki 값이 0.

후속연구

SKU31-1 균주를 이용한 α-glucosidase 저해제 violamine의 대량 생산 체계를 구축하기 위하여 저렴한 산업용 배지 개발과 대량배양 조건 확립을 위한 후속 연구가 필요하다고 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	α-Glucosidase 저해제는 어떤 병의 치료제로 개발이 가능합니까?	소장에 존재하는 α-glucosidase는 식이 중에 함유된 탄수화물을 단당류로 전환시켜 흡수를 가능하게 하는 탄수화물 소화에 필수적인 효소이다. α-Glucosidase 저해제는 섭취한 탄수화물의 흡수를 막고 바로 배출시켜 식후 혈당 저하를 유도하므로 type II 인슐린 비의존성 당뇨, 비만과 고지혈증 등의 대사 이상증 치료제로서의 개발 가능성(Heacock et al., 2005) 뿐만 아니라 항바이러스와 항전이 활성도 보고되어 다중 치료제로서 관심을 받고 있는 물질이다(Courageot et al.
	α-glucosidase는 무엇입니까?	소장에 존재하는 α-glucosidase는 식이 중에 함유된 탄수화물을 단당류로 전환시켜 흡수를 가능하게 하는 탄수화물 소화에 필수적인 효소이다. α-Glucosidase 저해제는 섭취한 탄수화물의 흡수를 막고 바로 배출시켜 식후 혈당 저하를 유도하므로 type II 인슐린 비의존성 당뇨, 비만과 고지혈증 등의 대사 이상증 치료제로서의 개발 가능성(Heacock et al.
	NB 배지에서 SKU31-1 균주는 α-glucosidase 저해 활성을 나타내었습니까?	배지 종류에 따른 균체 성장의 차이는 나타나지 않고 사용한 모든 배지 조건에서 8시간 후 급격하게 증가하기 시작하여 배양 30시간 후 균체 밀도가 최대값(109 CFU/ml) 에 도달한 후 약간 감소 후 유지되었으나, α-glucosidase 저해 활성은 배지에 따라 큰 차이를 나타내었다. NB 배지에서는 균체 생육은 잘 이루어졌으나 활성물질 생산은 전혀 이루어지지 않았고, TSB 배지에서는 미미한 정도의 활성을 나타낸 반면에 G배지에서는 3일 후부터 강한 저해활성을 나타냈다(Fig. 1).

참고문헌 (8)

Courageot, M.P., Frenkiel, M.P., Dos Santos, C.D., Deubel, V., and Despres, P. 2000. Alpha-glucosidase inhibitors reduce dengue virus production by affecting the initial steps of virion morphogenesis in the endoplasmic reticulum. J. Virol. 74, 564-572.

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Fowler, M.J. 2007. Diabetes Treatment, Part 2: Oral agents for glycemic management. Clin. Diabetes 25, 131-134.

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Heacock, P.M., Hertzler, S.R., Williams, J.A., and Wolf, B.W. 2005. Effects of a medical food containing an herbal a-glucosidase inhibitor on postprandial glycemia and insulinemia in healthy adults. J. Am. Diet. Assooc. 105, 65-71.
Kameda, Y., Asano, N., Yoshikawa, M., Takeuchi, M., Yamaguchi, T., and Matsui, K. 1984. Valiolamine, a new a-glucosidase inhibiting aminocyclitol produced by Streptomyces hygroscopicus. J. Antibiotics 37, 1301-1307.
Kim, S.D. 2013. a-Glucosidase inhibitor from Buthus martensi Karsch. Food Chem. 136, 297-300.

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Playford, R.J., Pither, C., Gao, R., and Middleton, S.J. 2013. Use of the alpha glucosidase inhibitor acarbose in patients with 'Middleton syndrome': normal gastric anatomy but with accelerated gastric emptying causing postprandial reactive hypoglycemia and diarrhea. Can. J. Gastroenterol. 27, 403-404.
Wang, C., Sun, Y., Wen, Q., Wang, G., Wang, Y., Qu, Q., Yang, G., and Hu, X. 2010. Novel reagents for quantitative analysis of valiolamine in biological samples by high-performance liquid chromatography with pre-column UV derivatization. Talanta 81, 1613-1618.

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Yuasa, H., Takada, J., and Hashimoto, H. 2001. Glycosidase inhibition by cyclic sulfonium compounds. Bioorg. Med. Chem. Lett. 11, 1137-1139.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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