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문제 정의
- 본 연구는 남조류 대발생이 일어났던 북한강 수역의 퇴적층에서 분리한 Anabaena circinalis 휴면포자의 발아에 미치는 환경요인들의 영향을 분석하였으며, 이를 통해 현장에서 휴면포자의 발아가 남조류 대발생에 미치는 영향을 고찰하였다.
제안 방법
- 2mL를 96 well plate의 각 hole마다 채우고 hole당 1개체씩 접종하였다. 30개체씩을 이용하여 모든 환경조건에 3반복(총 90개체)으로 총 14일간 배양 하였다. 휴면포자의 발아율은 24시간 간격으로 도립현미경 하에서 휴면포자가 발아하고 난 후의 빈포자의 형성을 확인하여 조사하였다.
- 배양은 온도 25°C, 광도 30 μmol m-2 s-1 (14L : 10D)에서 실시 하였다. pH 조건에 따른 휴면포자의 발아율 분석을 위해 CB 배지를 이용하여 pH 5부터 pH 12까지 여덟 가지 조건에서 실시하였다. pH 조절은 초기 CB배지 (pH 9)에서 HCl (pH 5~8)과 NaNO3 (pH 10~12)을 이용하여 조절하였다.
- pH 조건에 따른 휴면포자의 발아율 분석을 위해 CB 배지를 이용하여 pH 5부터 pH 12까지 여덟 가지 조건에서 실시하였다. pH 조절은 초기 CB배지 (pH 9)에서 HCl (pH 5~8)과 NaNO3 (pH 10~12)을 이용하여 조절하였다. 배양은 온도 25℃, 광도 30 μmol m-2 s-1 (14L : 10D)에서 실시하였다.
- 광조건에 따른 휴면포자의 발아율 분석을 위한 배양은 온도 25°C, 14L :10D의 광주기를 가진 배양기에서 0, 5, 15, 30, 50, 100μmol m-2 s-1의 여섯 단계 광도조건 하에서 실시하였다.
- 휴면포자의 발아율은 24시간 간격으로 도립현미경 하에서 휴면포자가 발아하고 난 후의 빈포자의 형성을 확인하여 조사하였다. 발아율은 각 실험군에 접종한 휴면포자의 총수에 대한 발아된 휴면포자 비율 (%) 로 계산하였으며, 14일간의 누적발아율의 변화를 평가 하였다.
- 광조건에 따른 휴면포자의 발아율 분석을 위한 배양은 온도 25°C, 14L :10D의 광주기를 가진 배양기에서 0, 5, 15, 30, 50, 100μmol m-2 s-1의 여섯 단계 광도조건 하에서 실시하였다. 영양염 조건에 따른 휴면포자의 발아율 분석을 위해 CB배지(N: 75 mg L-1, P: 7 mg L-1 포함)를 이용하여 질소와 인을 모두 첨가한 조건 (+N, +P in CB medium), 질소와 인이 모두 결핍된 조건(-N, -P in CB medium), 질소는 결핍, 인은 첨가한 조건(-N, +P in CB medium), 질소는 첨가, 인은 결핍된 조건(+N, -P in CB medium) 과 증류수 등 다섯 가지 조건하에서 실시하였다. 배양은 온도 25°C, 광도 30 μmol m-2 s-1 (14L : 10D)에서 실시 하였다.
- 온도조건에 따른 휴면포자 발아율 분석을 위해 광도는 30 μmol m-2 s-1로 일정하게 유지하고 광주기 14L :10D를 가진 배양기에서 온도 5, 10, 15, 20, 25°C의 다섯 가지 단계에서 배양을 실시하였다.
- 저층의 퇴적물에서 휴면포자 분리를 위해 100 mL 채집병에 담긴 퇴적물을 잘 섞은 후, 습중량 1 g (W/W)을 취한 후, 냉장 보관한 여과 (0.2 μm) 멸균수 (퇴적물을 채취한 곳의 현장수)로 현탁 시킨 뒤, 초음파기 (JAC 4020 type, 60 Hz, 620 w, Ultrasonic, Korea)로 20초간 2회 초음파 처리하여 현탁액을 분쇄하였다.
- 휴면포자 형태는 400x 배율 하에서 관찰하였으며 포자의 크기를 측정하였다. 포자가 발아한 후 영양세포로의 발달과정을 확인하기 위해 접종 후 하루 2회씩(오전, 오후) 일정한 시간에 세포의 길이와 폭을 측정하였다.
- 2 mL 주입한 후 분리한 휴면포자 세포를 접종하여 온도 25°C 및 광도 30~40 μmol m-2 s-1 (14L : 10D) 조건의 배양기에서 배양하였다. 휴면포자 형태는 400x 배율 하에서 관찰하였으며 포자의 크기를 측정하였다. 포자가 발아한 후 영양세포로의 발달과정을 확인하기 위해 접종 후 하루 2회씩(오전, 오후) 일정한 시간에 세포의 길이와 폭을 측정하였다.
- 30개체씩을 이용하여 모든 환경조건에 3반복(총 90개체)으로 총 14일간 배양 하였다. 휴면포자의 발아율은 24시간 간격으로 도립현미경 하에서 휴면포자가 발아하고 난 후의 빈포자의 형성을 확인하여 조사하였다. 발아율은 각 실험군에 접종한 휴면포자의 총수에 대한 발아된 휴면포자 비율 (%) 로 계산하였으며, 14일간의 누적발아율의 변화를 평가 하였다.
대상 데이터
- 남조류 Anabaena circinalis 휴면포자는 북한강수계 중 남조류가 대발생했던(2012년 7~9월) 청평호의 퇴적층에서 분리하였다. 퇴적물은 Van veen grab sampler (Q.
- 퇴적물은 Van veen grab sampler (Q.T. Technology, Korea)를 이용하여 퇴적물 표층 (1 cm)을 채취한 후, 100 mL 폴리에틸렌 채집병에 담아 냉장보관 (4~5°C)하여 실험실로 운반하였으며, 모든 시료는 분석전까지 냉암소에 보관하였다.
데이터처리
- 각 실험의 조건별로 A. circinalis 휴면포자 발아율 차이를 비교하기 위하여 SPSS package (ver. 18.0. SPSS Inc., USA)를 이용하여, 각 조건의 시간별 반복 실험군의 평균 발아율을 이용하여 One-Way ANOVA (Duncan’s multiple-range test)를 실시하였다.
이론/모형
- 여과된 시료는 Panning method (Matsuoka and Fukuyo, 2000)에 따라, 여과수와 함께 총 10 mL로 농축하여 암갈색 유리병에 옮겨 담아 냉장보관 (4°C)하였다.
성능/효과
- 5와 같다. pH 7, pH 8 조건에서 발아율은 모두 55% 이상으로 가장 높았다. pH 9와 pH 10의 조건에서는 각각 45%, 40% 이상의 발아율을 나타내었으며, 이는 pH 7~8 조건에 비해 10% 이상 낮았으나 통계적인 유의성은 없었다 (p>0.
- 결론적으로, 다양한 이화학적 요인 및 생물학적 작용들이 Anabaena 휴면포자의 발아에 영향을 미치며 개별 요인 내에서도 발아율은 조건의 변화에 따라 다르게 나타난다. 더욱이 현장에서의 휴면포자 발아에 대해서는 어느 한가지만 작용하는 것이 아니므로 본 연구에서 분석한 환경요인들 이외의 다른 요인들 까지를 포함하여 복합적인 영향을 받을 것이다(Tsujimura, 2004; Kang et al.
- 이러한 결과는 휴면포자가 발아한 후 세포들이 연결된 세포사가 성장하는 과정에서, 초기에는 폭이 증가하지만 점차로 폭의 성장이 길이성장으로 전환됨을 의미한다. 또한 이 시기 동안 세포 형태에 있어 중요하게 구분되는 이형세포(heterocyst) 가 관찰되었는데, 이는 배지 내 질소원의 감소와 관련이 있는 것으로 판단되었다. 이형세포의 외형은 원형이고 직경은 6~8 μm이다 (Fig.
- 또한, 20℃에서는 약 20%의 발아율을 보여, 보다 활발한 휴면포자 발아를 위해서는 20°C 이상의 높은 수온이 요구되는 것으로 나타났다.
- 배양 3일 이후부터 포자가 영양세포로 발달하면서 길이 성장을 보였으며, 배양 6일째에는 길이 53~55 μm, 폭 10~11 μm 로 길이는 증가하지만 폭은 감소하였다.
- 이 경우 바람의 작용으로 인해 휴면포자를 포함하는 퇴적물이 유광대로 떠오를 수 있으며, 또한 퇴적층에 빛이 직접 도달함으로써 휴면포자 발아에 충분한 광을 제공할 수 있다(Karlsson-Elfgren, 2003). 본 연구 결과, 광이 없는 조건에서 휴면포자 발아가 일어나지 않음으로써 A. circinalis 휴면포자는 발아를 위해 광을 필요로 함을 확인하였다. 한편, 수심이 깊은 지역이라 할지라도 빛이 투과할 수 있는 수역에서는 휴면포자가 발아할 가능성이 있을 것이다(Baker, 1999).
- , 2004). 본 연구결과, 산성(pH 5~6) 과 알칼리성(pH 11~12) 조건에서는 매우 낮거나(10%이하) 제로 수준의 발아율을 보인 반면, pH 7~10까지의 중성 및 약알칼리성 조건에서는 40~60%의 높은 발아율을 보였다. 이와 같은 결과는 선행 연구들의 결과와도 일치하였다.
- 본 연구는 북한강수역에서 남조류 Anabaena circinalis 대발생의 1차적 원인을 제공하는 휴면포자의 발아가 수온, 광도, 영양염, pH 등 이화학적 요인에 의해 영향을 받으며 발아율의 정도는 각 요인의 범위에 따라 차이가 있음을 보여주었다.
- Huber (1985)는 Nodularia spumigena의 휴면포자는 인산염 첨가시 발아가 미비하였으나 질소 첨가시 70~80% 발아율을 나타냈다고 보고하였으며, Van Dok and Hart (1997)는 Anabaena circinalis의 휴면포자가 낮은 인산염 농도에서도 높은 발아율을 보임에 따라 인산염이 발아에 중요한 인자가 아니라고 보고하였다. 본 연구에서는 인보다는 질소의 첨가가 Anabaena circinalis 휴면포자 발아에 더 큰 영향을 나타내었다(Fig. 6). 이러한 결과는 종래의 담수생태계 조류관리에 있어 인제한(P-limitation)의 일변도의 패러다임에 대하여 질소의 생태학적 역할에 대한 관심을 환기시킨다.
- 일반적으로 영양염인 질소와 인은 남조류의 휴면포자발아에 영향을 준다고 알려져 있다(Agrawal and Misra, 2002). 본 연구에서는 질소와 인이 결핍된 조건에서 낮은 발아율을 보였으나, 질소와 인 모두 충족된 조건에서는 가장 높은 발아율을 나타냈다 (Fig. 4). Westiellopsis prolifica 휴면포자는 질소나 인이 결핍된 조건과 비교할 때 질소나 인이 충족된 조건에서 5배 이상의 발아율을 보였으며 (Agrawal and Sharma, 1994), Nodularia spumigena 휴면포자는 인농도의 증가 (>0.
- 본 연구에서도 5 μmol m-2 s-1부터 30 μmol m-2 s-1까지 발아율이 증가하는 경향을 보였다(Fig. 3).
- 본 연구에서도 A. circinalis 휴면포자는 10°C 내외의 저수온 조건에서도 10% 내외의 누적발아율을 보임으로써 상대적인 발아율이 낮지만 10°C 내외의 저층의 수온에서도 발아를 통한 수중의 영양세포 증식에 기여할 가능성은 있는 것으로 파악되었다.
- 이는 다른 연구의 결과와도 일치하는데, Anabaena cylindrica 휴면포자가 2~60 μmol m-2 s-1의 범위에서 광도가 증가함에 따라 발아율이 증가하였으며(Yamamoto, 1976), Stigeoclonium pascheri 휴면포자는 5 μmol m-2 s-1에서 70 μmol m-2 s-1로, Pithophora oedogonia 휴면포자는 10 μmol m-2 s-1에서 30 μmol m-2 s-1로 증가함에 따라 발아율이 증가하였다(Agrawal, 1986). 이러한 결과로 판단할 때 남조류의 휴면포자는 수심이 깊은 수역보다는 3m 이하의 얕은 수역에서 발아가능성이 높다. 이 경우 바람의 작용으로 인해 휴면포자를 포함하는 퇴적물이 유광대로 떠오를 수 있으며, 또한 퇴적층에 빛이 직접 도달함으로써 휴면포자 발아에 충분한 광을 제공할 수 있다(Karlsson-Elfgren, 2003).
- 즉, 늦은 봄 이후 여름철로 가면서 높은 수온(20°C 이상)과 저층의 낮은 광도(발아에 필요한 최소한의 광도), 퇴적층 내의 질소와 인의 이용성 증가, 중성 및 약알칼리성 pH 등의 복합적인 환경요인이 잘 조합되었을 때 A. circinalis 휴면포자 발아에 trigger로 작용 하여 Anabaena의 대발생으로 이어질 가능성이 크다.
- 반면, 질소와 인을 모두 결핍시킨 조건(-N-P)과 인은 첨가하였으나 질소를 결핍시킨 조건(-N+P)에서의 발아율은 각각 10%, 25%를 나타냈다. 즉, 질소가 첨가된 모든 조건에서는 55% 이상의 높은 발아율을 나타낸 반면, 질소가 없는 조건에서는 20% 이하의 낮은 발아율을 나타내었다. 질소와 인이 모두 첨가된 조건에서 가장 높은 발아율을 나타냄에 따라, 충분한 질소와 인, 특히 질소는 A.
- 즉, 질소가 첨가된 모든 조건에서는 55% 이상의 높은 발아율을 나타낸 반면, 질소가 없는 조건에서는 20% 이하의 낮은 발아율을 나타내었다. 질소와 인이 모두 첨가된 조건에서 가장 높은 발아율을 나타냄에 따라, 충분한 질소와 인, 특히 질소는 A. circinalis 휴면포자 발아에 중요한 인자로 나타났다. 증류수 조건 (control)에서 발아가 전혀 일어나지 않았다.
- 휴면포자 발아율은 25°C>20°C>15≒10°C >5°C 순으로 높았으며, 저수온 조건인 5, 10, 15°C와고수온 조건인 25°C에서 뚜렷한 발아율의 차이를 보였다(p<0.05, Fig.6).
- 1-c). 휴면포자가 시스트로부터 빠져나올 때의 크기가 발아되지 않은 상태의 휴면포자 크기에 비해 약간 큰 것으로 판단할 때, 휴면포자는 발아과정에서 이미 세포성장이 시작된 것으로 판단되었다. 배양 3일 이후부터 포자가 영양세포로 발달하면서 길이 성장을 보였으며, 배양 6일째에는 길이 53~55 μm, 폭 10~11 μm 로 길이는 증가하지만 폭은 감소하였다.
- 휴면포자를 발아시켜 배양한 Anabaena 영양세포를 이용하여 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 본 연구에서 이용한 휴면포자는 A. circinalis 종으로 동정되었다(Han River Watershed and Environment Management District, 2013). 본 연구와 동일한 수역에서 현장시료 (영양세포)를 채취하여 분석한 선행연구(Li et al.
후속연구
- 특히, 휴면포자 발아를 통한 Anabaena 대발생을 관리 하는 측면에서는 대부분의 영향요인 (특히 수온, 빛, pH 등)들을 제어할 수 있는 것이 아니므로 해당 수역에서 휴면포자 발아조건 및 생활사에 대한 보다 심도 있는 이해를 통해 조류번성을 예측 대비하고 그에 맞는 대책을 마련하는 쪽으로 초점을 맞추어야 할 것이다. 다만 영양염 증가는 인위적인 활동에 기인하는 경우가 대부분이므로 하천으로의 하수처리방류수나 지천으로부터의 유입되는 오염수의 관리가 필요하고 특히 오염수의 유입이 있는 수역에 초첨을 맞추어 휴면포자의 분포와 발달에 대한 이해와 그에 맞는 관리대책을 고려함이 바람직하다고 사료된다.
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