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문제 정의
- 간과 아가미에서는 항산화 효소(GSH, GPx, SOD)를, 뇌와 근육에서 AChE의 활성을 검토하기 위하여 다음과 같이 진행하였다. 적출한 각 기관은 washing buffer (0.
- 따라서 본 연구는 국내 주요 양식종인 돌돔(Oplegnathus fasciatus)에 대한 구리의 만성적 영향을 알아보기 위해서 혈액, 간, 아가미, 뇌 및 근육에서 구리 독성과 관련 있는 일련의 효소들의 활성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 돌돔(O. fasciatus)에서 구리의 만성적 노출에 따른 어류의 생리 활성 변화를 파악할 수 있는 biomarker 조사를 위해 혈청 효소 및 간과 아가미에서의 항산화 효소와 뇌와 근육에서의 AChE의 활성을 측정하였다. 이전 연구에 따르면 구리에 대한 돌돔의 24시간 반수치사농도(LC50)는 1.
제안 방법
- AChE 활성은 Ellman (1961)의 방법을 기초로 하여 변형된 방법으로 측정하였다. 시료를 효소 측정 범위 내로 50 mM TrisHCl buffer (pH 7.
- GPx 효소 활성은 Bell et al. (1985)의 변형된 방법으로 측정하였고, H2O2를 기질로, sodium axide를 catalase 억제제로 사용 하였다. 시료에 1 mM GSH, 0.
- LLC)를 증류수에 용해시켜 stock solution을 만든 후, 여과해수로 희석하여 노출농도가 각각 0, 200 및 400 μg/L이 되도록 설정하였다. 돌돔은 각 농도에 10일 및 20일간 노출시킨 후, heparin-Na (5,000 I.U., 중외제약)을 처리한 주사기를 이용하여 미부 정맥에서 채혈한 후, 간, 아가미, 뇌 및 근육을 적출하였다. 모든 실험은 2회 반복 실시하였다.
- 본 연구에서는 기존 연구자료와 예비실험을 바탕으로 만성적 구리 노출을 위하여 농도를 200과 400 μg/L로 설정하여 실험하였다.
- 실험 용액은 Copper (II) sulfate minimum 99% (CuSO4 , Sigma-Aldrich Co. LLC)를 증류수에 용해시켜 stock solution을 만든 후, 여과해수로 희석하여 노출농도가 각각 0, 200 및 400 μg/L이 되도록 설정하였다.
- 실험은 항온실(20±1℃)에서 유리수조(50×28×31 cm)를 사용하여 1일마다 실험용액을 교환하는 환수식으로 실시하였고, 실험조건은 Table 1과 같다.
대상 데이터
- 돌돔(Oplegnathus fasciatus)은 경남소재 양식장으로부터 분양 받아 실험실 조건에서 4주 이상 순치 시킨 후, 외관상 질병증세가 없는 건강한 개체(전장, 12.14±1.03 cm; 체중, 33.78±1.74 g)를 선별하여 실험구별 12마리씩 수용하여 실험 하였다.
데이터처리
- 실험 분석 결과에 대한 통계학적 유의성은 SPSS 통계 프로그램(SPSS Inc.)을 이용하여 ANOVA test를 실시하고, 사후검정으로 Duncan’s multiple range test를 통해 P<0.05일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- GSH 함량은 Richardson and Murphy (1975)의 방법에 의하여 측정하였다. 일정량의 시료에 working solution (0.
- 조직의 단백질 함량의 측정은 Bradford (1976) 방법으로 측정하였고, Bovine gamma globulin (Sigma, USA)을 이용하여 표준 검량선을 작성하였다.
- 채혈한 혈액은 1시간 동안 실온에 방치한 후, 4℃에서 6,000rpm으로 5분간 원심 분리 (MICRO 22R, Hettich, Germany)하여 혈청을 분리하였다. 효소활성 검토를 위해 ALT 및 AST는 Reitma-Frankel법으로, LDH는 LDH 젖산 기질법에 의하여 임상용 kit (Asan Pharm. Co., Ltd.)를 이용하여 분석하였다.
성능/효과
- AST (KU)도 ALT와 유사하게 구리에 노출된 모든 실험구에서 대조구에 비하여 유의하게 높은 값을 보였으나(P<0.05), 노출 기간 및 농도에 따른 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
- 본 연구에서 보인 구리 노출에 따른 돌돔의 간과 아가미에서의 SOD의 증가도 이와 같은 맥락에서 해석될 수 있을 것이다. 구리에 노출된 돌돔의 간에서는 구리 농도 및 노출 기간에 따른 SOD의 증가가 관찰되었고, 아가미에서는 농도 및 노출기간과는 상관없이 구리에 노출된 모든 실험구에서 유의한 증가를 보였다(Fig. 2). SOD는 CAT, GPx 및 GSH롤 포함하여 중금속에 의해 발생된 ROS에 대한 첫 번째 방어선으로서, superoxide 와 hydrogen peroxide를 제거하는 역할을 담당한다(Hayes and McLellan, 1999).
- 그러나, 돌돔의 혈청 LDH (IU/L) 활성은 단지 노출 20일째에 400 μg/L 실험구에서만 대조구에 비하여 유의하게 높은 값을 보였다(Table 2).
- 또한, 기수어인 망둥어(Pomatoschistus microps)에서는 근육의LDH (U/mg protein)가 구리(200 및 400 μg/L) 및 수은(25 및 50 μg/L)에 의해서 유의하게 증가하였다.
- 를 분해하는 과정인 redox-cycle에서 antioxidant enzymes으로서의 그 기능을 한다(Winston and Giulio, 1991). 본 연구에서 구리에 노출된 돌돔의 간 및 아가미에서 GPx는 감소하였다(Fig. 3). 이러한 감소는 노출 농도 및 노출 기간에 따라 더욱 가속화 되었는데, 이는 포유류 및 다른 어종에서도 유사한 결과이다(Ossola et al.
- 혈청 내 효소성분인 ALT와 AST는 해당 효소를 이루는 필수아미노산과 탄수화물 대사에 중요한 역할을 하며, 정상 조건에서는 혈중에 미량으로 존재하나, 간, 심장 및 근육의 조직학적 손상이나 이상 발생시 혈중 농도가 높아지는 것으로 알려져 있어, 어류에 있어 독성물질에 대한 모니터링 지표로 사용되고 있다(Blasco and Puppo, 1999). 본 연구에서 보인 혈중 ALT와 AST 증가도 이와 같이 구리의 만성적 노출에 의한 여러 장기의 조직학적 손상이 원인이라고 판단된다. LDH는 젖산을 분해하고 재합성하는 효소로, 스트레스를 받았때 생성된 젖산으로 인한 혈액의 산성화를 제어하는 기능을 하며, 유해물질에 의해 에너지 생산 경로에 이상이 발생할 경우 그 활성이 변한다(Vieira et al.
- , 2005). 본 연구에서, GSH가 증가한 것으로 보아 GR과 마찬가지로 GPx의 감소 또한 GSH의 산화를 감소시켜 환원된(reduced) GSH의 축적을 유도하여 돌돔의 정상적인 redox cycling을 방해하였을 것으로 사료된다.
- 이 활성 수치는 돌돔과 같은 농어목인 참돔(Pagrus major)의 뇌와 근육에서 조사된 바와도 유사하였다(Kim, 2013). 본 연구에서, 구리에 노출된 돌돔의 AChE 활성을 조사한 결과, 뇌에서는 노출 10일 째부터 유의한 감소가 관찰되었고, 근육에서는 20일째에 유의한 감소가 관찰되었다(Fig. 4). 이와 유사하게 cadmium에 노출된 잿방어(Seriola dumerili)와 제초제에 노출된 은메기(Rhamdia quelen)에서도 AChE의 활성이 유의하게 감소됨이 보고되었다(Jebali, 2006; Miron et al.
- 본 연구에서, 돌돔의 AChE의 활성은 뇌에서는 40±5.2로, 근육의 25±1.2 nmol/min/mg protein보다 약 1.6배 정도 높았다(Fig. 4).
- , 2006). 본 연구에서는 구리의 산화적 스트레스에 대한 표적 장기로 간과 아가미를 선택하였으며, 그 결과, 아가미의 GSH, SOD 및 GPx, 모두 간에서 보다는 낮은 활성을 보였지만, 구리 노출에 따른 활성 반응양상은 간에서와 유사하였다(Fig.1-3). 또한, 본 연구에서 항산화 효소 활성의 변화가 간에서는 노출 20일차에 유의하게 나타난 것 비해 아가미에서는 노출 10일차에 좀 더 빨리 나타난 것은, waterborne 노출 시, 구리의 주요 축적 장기는 간과 아가미이지만, 주요 흡수 경로가 아가미일뿐만 아니라, 구리로 인한 아가미 점막 손상 때문인 것으로 사료된다(Campbell et al.
- 본 연구에서는 노출 20일째, 200 μg/L 실험구를 제외하고, 구리에 노출된 모든 실험구의 돌돔의 간과 아가미에서 GSH의 구리 농도에 따른 유의한 증가가 관찰되었다(Fig. 1).
후속연구
- , 2009). 그러나, 이들 어종에 대한 구리의 노출기간은 단지 4일이었으나, 본 연구에서는 노출 기간이 10일과 20일로 길었음에도 불구하고 LDH활성의 증가 현상이 지속적으로 나타난 점을 주목해 볼 때, 만성적 구리 오염에 대한 specific biomarker로써의 가능성을 제시할 수 있을 것이다.
- 이상의 논의로부터 만성적 구리 노출에 대한 돌돔의 혈청 효소와 항산화 효소 및 신경전달물질 활성의 변동은 연안 구리 오염에 대한 모니터링의 수단으로 이용될 수 있을 것으로 사료되며, 항산화 효소에 있어서는 돌돔의 간뿐만 아니라 아가미도 해양 모니터링의 재료로써 가치가 있을 것으로 판단된다.
- , 2003). 하지만, 구리를 포함하여 중금속 노출에 따른 AChE에 관한 연구는 미비하기 때문에 AChE 저해 제로 알려진 tetrodotoxin (Shin et al., 2003) 등을 이용하여 보다 명백한 규명을 위한 연구가 필요할 것이다.
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