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문제 정의
- PCR분석은 mutant균주가 crystal protein을 형성하지 못하는 원인이 cry gene의 결실에 있는지 확인하기 위하여 수행하였다. KB098균주의 모든 plasmid DNA를 대상으로 수행한 PCR에서는 보고된 바와 같이 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4가지의 cry gene에서 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다.
제안 방법
- 8, 10% SDS, TEMED, 10% Ammonium Persulfate)로 SDS-PAGE를 수행하였다. 60 V에서 140분간 전기영동을 실시하였고, 전기 영동이 끝난 gel은 0.1% Coomassie brilliant blue로 염색 하여 band pattern을 확인하였다(Fig. 2).
- Crystal-coding plasmid DNA plasmid DNA의 sequence는 주식회사 마크로젠에 의뢰하여 primer walking분석을 통해 sequence를 읽어내었다. Sequence는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 NT0423과의 차이점을 비교하였다.
- Crystal-coding plasmid DNA를 agarose gel에서 재추 출하기 위해 Qiaquick gel extraction kit를 사용하여 gel extraction하였고 QiaexⅡgel extraction kit는 Qiaquick gel extraction kit를 이용한 결과가 정확한지를 확인하기 위해 사용하였다. Qiaquick gel extraction kit는 protocol 대로 사용하였다.
- 5 ml eppendorf tube설치한 후 EB buffer를 20 ㎕ 칼럼에 넣은 후 1분간 반응시키고 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 DNA를 용출시킨 후 실험에 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. Gel extraction sample의 확인은 0.8% agarose gel에서 50 V로 60분간 전기영동 하여 band를 확인하였고(Fig. 6), crystal-coding plasmid DNA band의 cry gene 확인은 PCR을 수행한 후 1.5% agarose gel에서 50 V로 35분간 전기영동 하여 확인하였다 (Fig. 7). QiaexⅡgel extraction kit는 protocol대로 사용하였다.
- KB098균주와 5개의 mutant균주들의 plasmid DNA추 출은 QIAGEN midi kit의 protocol을 변형하여 사용하였 다. 균주를 LB배지 5 ml에 접종하여 27℃ 180 rpm으로 8시간 배양한다.
- KB098균주와 5개의 mutant균주를 NA배지에 spreading 하여 27℃ 배양기에서 5일간 배양한 후 autolysis가 일어난 것을 확인한 후 일회용백금이로 집균하였다. 15,000 rpm 으로 15분간 원심분리하여 상청액 제거 후 5 ml의 멸균수를 첨가하여 spore-crystal 혼합액을 만들고 모든 샘플은 washing Ⅰ (500 mM NaCl, 2% Triton X-100) 용액에서 2번, washing Ⅱ (500 mM NaCl)용액에서 3번 세척되어졌 다.
- Qiaquick gel extraction kit는 protocol 대로 사용하였다. KB098균주의 plasmid DNA를 전기 영동한 agarose gel로부터 crystal-coding plasmid DNA band를 날카로운 메스로 절단하였다. QG buffer를 gel 무게의 3배 volume으로 넣고 50℃에서 2분 간격으로 vortexing하며 10분간 녹인다.
- Nutrient agar plate에 배양된 colony 중 위상차현미경으로 관찰하였을 때 bipyramidal형태의 crystal protein이 가장 뚜렷한 colony를 선발하여 LB배지에서 24 h, 27℃, 180 rpm으로 진탕 배양하여 spore를 cell상태로 만든 후 멸균수를 이용하여 1×102 cfu/ml 농도로 희석하고 NA배지에 200 μl를 spreading하여 42℃ 배양기에서 48 h배양한 colony 중 위상차현미경 관찰을 통해 crystal protein을 형성하지 않는 colony를 선발하였다.
- PCR증폭에는 DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer등이 함유된 premix (Bioneer)에 주형 DNA 1 ㎕, primer set 각각 1 ㎕, 증류수 17 ㎕를 혼합하여 최종볼륨을 20 ㎕로 하여 수행하였다. PCR condition은 94℃ 5분, 30 cycles, 94℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 5분으로 수행하여 PCR product를 생산하였으며 1.5% agarose gel에서 전기영동 하여 확인하였다(Yang et al., 2011; Abdullah et al., 2009; Ye et al., 2009)(Fig. 3, 4).
- Crystal-coding plasmid DNA band안에 존재하는 cry gene은 4종류의 primer를 사용한 PCR을 통해 확인하였 다. PCR산물은 1.5% agarose gel 전기영동을 통해 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D의 존재를 확인하였다(Fig 7). 이 결과를 통해 KB098의 cry gene은 가장 큰 size의 plasmid DNA에 암호화 되어 있음을 증명하였다.
- PCR 증폭은 Thermal Cycler C1000 TM (BIO-RAD)을 사용 하였다. PCR증폭에는 DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer등이 함유된 premix (Bioneer)에 주형 DNA 1 ㎕, primer set 각각 1 ㎕, 증류수 17 ㎕를 혼합하여 최종볼륨을 20 ㎕로 하여 수행하였다. PCR condition은 94℃ 5분, 30 cycles, 94℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1분, 72℃ 5분으로 수행하여 PCR product를 생산하였으며 1.
- 상청액을 버리고 멸균수를 첨가한 후에 실험에 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다. SDS-PAGE는 Laemmli(1970) 의 방법을 약간 수정하여 12% separating gel (30% Acrylamide/Bis, 1.5 M Tris-HCl. pH5 8.8, 10% SDS, TEMED, 10% Ammonium Persulfate)과 4% stacking gel (30% Acrylamide/Bis, 1 M Tris-HCl. pH 6.8, 10% SDS, TEMED, 10% Ammonium Persulfate)로 SDS-PAGE를 수행하였다. 60 V에서 140분간 전기영동을 실시하였고, 전기 영동이 끝난 gel은 0.
- Crystal-coding plasmid DNA plasmid DNA의 sequence는 주식회사 마크로젠에 의뢰하여 primer walking분석을 통해 sequence를 읽어내었다. Sequence는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에서 NT0423과의 차이점을 비교하였다.
- thuringiensis subsp. aizawai KB098 균주를 Nutrient agar plate에 streaking 한 후 위상차현미경으로 관찰하여 활성이 좋은 colony를 선발하여 사용하였다(Kim et al., 2009).
- thuringiensis subsp. aizawai KB098균주가 지금까지 보고된 Bt균주보다 파밤나방과 담배거세미나방의 두 종류의 해충에 활성이 높게 나타나므로 이를 유전학적으로 구명하고자 crystal-coding plasmid DNA의 sequence 비교를 검토하였다.
- thuringiensis subsp. aizawai KB098균주와 Crymutant균주인 MKB098-91, MKB098-108, MKB098-110, MKB098-125, MKB098-130 등 5개를 NA배지에 spreading 하여 27℃ 배양기에서 5일간 배양한 후 위상차현미경으로 autolysis가 일어난 것을 확인한 후, 일회용 백금이로 집균하였다. 15,000 rpm으로 15분간 원심분리 한 후에 상청액을 버리고 5 ml의 멸균수를 첨가하여 spore-crystal 혼합 액을 만들어 실험에 사용하였다.
- thuringiensis subsp. aizawai KB098균주의 crystal-coding plasmid DNA의 위치를 확인하기 위해 42℃ 배양을 통하여 얻어진 mutant 균주와의 plasmid DNA band pattern을 비교하였다. 0.
- 각각의 petri dish에 0.5 g의 인공사료를 넣고 10 7 cfu/ml 농도의 균을 100 ㎕씩 살포하였고, 2 h 음건 후에 petri dish당 파밤나방 2령 유충을 5마리씩 접종하였고 6반복으로 치사율을 조사하였다. 생물검정은 5일간 실시하였고 온도 25±2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50-60%의 조건에서 보관하였다(Table 1).
- cfu/ml 농도로 희석하고 NA배지에 200 μl를 spreading하여 42℃ 배양기에서 48 h배양한 colony 중 위상차현미경 관찰을 통해 crystal protein을 형성하지 않는 colony를 선발하였다. 선발된 균주를 NA배지에 streaking 한 후 27℃ 배양기에서 4-5일간 배양하여 위상차현미경을 통해 crystal protein 형성유무를 확인하여 없는 것으로 선발하였다(Fig. 1).
- 8% 비율로 혼합하여 열을 가해 녹인 후 gel tray에 붓고 20분간 굳힌 agarose gel을 사용하였다. 전기 영동장치에 gel과 동일한 1✕TAE buffer를 gel 위로 3-5 mm정도 올라오게 붓고 loading dye와 loading star를 5:1 의 비율로 섞은 혼합액과 plasmid DNA sample을 1:5의 비율로 혼합하여 각각의 well에 넣고 50 V에서 60분간 전기영동한 후 UV를 쬐어 band pattern을 확인하였다(Fig. 5).
- 파밤나방에 높은 활성을 나타내는 KB098균주의 crystal protein 분자량 확인과 curing 과정을 통해 생성된 mutant의 crystal protein 존재유무를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. KB098균주는 다른 문헌에서와 마찬가지로 bipyramid형태의 crystal protein 분자량에 해당하는 130~145 kDa의 band가 형성되는 것을 확인하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 나비목 해충인 파밤나방(Spodoptera exigua)은 농촌진흥청 농업기술과학원으로부터 분양받아 유충은 인공사료를 성충은 10% (v/v) 설탕물을 사용하여 실험실에서 누대 사육하여 사용하였다. 모든 곤충은 온도 25±2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50-60%의 조건에서 사육되었다.
이론/모형
- Cry gene이 암호화 되어있는 23.1 kbp 이상의 가장 큰 plasmid DNA만을 추출하기 위해 agarose gel에서 직접 plasmid DNA를 추출하는 gel extraction 기법을 사용하였 다. Crystal-coding plasmid DNA band는 23.
- thuringiensis subsp. aizawai KB098균주와 Crymutant의 cry gene 존재유무를 확인하기 위해 gene-specific primer set를 사용하였다(Jung et al., 2010)(Table 2). PCR 증폭은 Thermal Cycler C1000 TM (BIO-RAD)을 사용 하였다.
성능/효과
- aizawai KB098균주의 crystal-coding plasmid DNA의 위치를 확인하기 위해 42℃ 배양을 통하여 얻어진 mutant 균주와의 plasmid DNA band pattern을 비교하였다. 0.8% Agarose gel 전기영동을 통해 KB098균주와 5개의 mutant 균주들 간에 plasmid DNA band pattern을 확인한 결과 KB098균주가 갖는 가장 큰 size의 plasmid DNA가 mutant에서 결실이 일어났음을 확인하였다. Mutant 균주들은 crystal-coding plasmid DNA의 결실이 일어났음이 PCR 을 통해 확인되었기 때문에 42℃배양을 통해 결실된 plasmid DNA는 crystal-coding plasmid DNA이고, 그위치는 KB098균주의 가장 큰 size이다.
- , 2008, Thammasittirong and Attathom, 2008). 1.5% Agarose gel을 이용한 전기영동 결과 PCR산물의 크기는 알려진 바와 같이 cry1Aa가 782 bp, cry1Ab가 238 bp, cry1C가 288 bp, cry1D가 465 bp로 나타났다. Mutant균 주의 모든 plasmid DNA를 대상으로 수행한 PCR에서는 어떠한 cry gene도 증폭이 되지 않았다.
- 파밤나방에 높은 활성을 나타내는 KB098균주의 crystal protein 분자량 확인과 curing 과정을 통해 생성된 mutant의 crystal protein 존재유무를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 수행하였다. KB098균주는 다른 문헌에서와 마찬가지로 bipyramid형태의 crystal protein 분자량에 해당하는 130~145 kDa의 band가 형성되는 것을 확인하였다. Crystal protein 을 형성하지 않는 mutant는 130-145 kDa의 band가 형성 되지 않음을 확인하였다.
- KB098균주는 autolysis 가 일어나기 전에는 cell안에 spore와 crystal protein을 가지고 있다가 autolysis이후에 spore와 crystal protein 이 cell밖으로 나출되는 것이 관찰되었다. KB098균주를 42℃에서 배양하여 얻은 Cry-mutant균주는 위상차현미경 관찰결과 autolysis 전과 후에서 모두 spore만이 관찰되어 crystal protein을 생성하는 능력이 소실되었음을 확인 하였다.
- KB098균주와 Cry-mutant균주와의 살충활성 비교를 통해 mutant균주의 살충활성 능력이 결여되었음을 확인하였다. KB098균주의 spore-crystal 현탁액이 100% 사충율을 나타내는 10 7 cfu/ml농도를 인공사료에 처리한 후 파밤 나방 2령충을 대상으로 생물활성검정을 실행하였을 때 mutant균주에서는 최대 12%의 사충율이 나타나 살충활성 능력이 없는 것으로 평가되었다.
- KB098균주와 Cry-mutant균주와의 살충활성 비교를 통해 mutant균주의 살충활성 능력이 결여되었음을 확인하였다. KB098균주의 spore-crystal 현탁액이 100% 사충율을 나타내는 10 7 cfu/ml농도를 인공사료에 처리한 후 파밤 나방 2령충을 대상으로 생물활성검정을 실행하였을 때 mutant균주에서는 최대 12%의 사충율이 나타나 살충활성 능력이 없는 것으로 평가되었다. 이는 mutant균주가 crystal protein을 생성하지 못함을 의미한다.
- PCR분석은 mutant균주가 crystal protein을 형성하지 못하는 원인이 cry gene의 결실에 있는지 확인하기 위하여 수행하였다. KB098균주의 모든 plasmid DNA를 대상으로 수행한 PCR에서는 보고된 바와 같이 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D 4가지의 cry gene에서 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다. 이는 다른 문헌들의 B.
- 1 kbp 이상에 존재하는 KB098균주에서 가장 큰 size의 plasmid DNA이다. Qiaquick gel extraction kit를 이용하여 gel extraction을 하였고, 산물의 크기는 23.1 kbp 위치에서 band가 형성됨을 확인하였다(Fig. 6). 산물의 크기를 재확인하기 위해 QiaexⅡgel extraction kit를 사용하였고 결과는 Qiaquick gel extraction kit와 동일하게 23.
- thuringiensis subsp. aizawai KB098균주는 위상차 현미경의 관찰결과 나비목 해충에 살충력을 나타낸다고 알려져 있는 bipyramid형태의 crystal protein을 형성하는 특징을 가지고 있는 것으로 나타났다. KB098균주는 autolysis 가 일어나기 전에는 cell안에 spore와 crystal protein을 가지고 있다가 autolysis이후에 spore와 crystal protein 이 cell밖으로 나출되는 것이 관찰되었다.
- 6). 산물의 크기를 재확인하기 위해 QiaexⅡgel extraction kit를 사용하였고 결과는 Qiaquick gel extraction kit와 동일하게 23.1 kbp에서 band가 형성 됨을 확인하였다.
- 생물검정은 5일간 실시하였고 온도 25±2℃, 광조건 16L:8D, 상대습도 50-60%의 조건에서 보관하였다(Table 1).
- 5% agarose gel 전기영동을 통해 cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D의 존재를 확인하였다(Fig 7). 이 결과를 통해 KB098의 cry gene은 가장 큰 size의 plasmid DNA에 암호화 되어 있음을 증명하였다.
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