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문제 정의
- 본 연구에서는 기존 이광자현미경 식물연구에서 사용된 여기 광 파장인 780 nm에서 벗어나서 장파장 여기 광을 사용하여 영상 깊이를 측정해보았고, 이광자 형광 광을 분광 측정하여 장파장 여기 광에 따른 식물의 이광자 형광 반응에 대해 고찰하였다.
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본 연구에서는 식물연구에 많이 사용되는 arabidopsis thaliana의 in vivo 이광자현미경 영상촬영에서 여기 광 파장에 따른 촬영깊이와 엽록소의 형광 스펙트럼 변화를 관찰하였다.
제안 방법
- 후)형광스펙트럼을">형광 스펙트럼을 얻을 수 있지만, 한 스펙트럼을 얻는데 30초 정도 걸리기 때문에 시간에 따른 스펙트럼 변화를 관측하는 데에는 적합하지 않다. 그러므로 시간에 따른 스펙트럼 변화 측정에는 dichroic mirror와 필터로 형광 광을 분할하여 다중채널로 영상 측정하였다.
- 후)본연구에서도">본 연구에서도 이광자현미경 연속 촬영을 하면서 스펙트럼의 변화를 2채널 분광측정으로 관찰하였다. 여기 시간에 따른 영상 촬영에는 엽록체의 미세한 움직임에 의한 영향을 배제하기 위하여 z방향으로 약 6 마이크론 두께로 volume scan 하였고 이를 projection하여 1개 프레임으로 만들었다. 프레임 영상 데이터 분석에는 엽록체만을 분석하기 위하여 여기 광 파장 변화에 따른 이광자현미경 영상의 촬영깊이 비교를 위해 같은 샘플 영역에서 800 nm 그리고 1100 nm 파장의 여기 광으로 3차원으로 촬영하였고, 이 중 x-z 단면에서의 엽록소 분포가 그림 2에 제시되었다. 밝은 초록색으로 보이는 것이 이광자 후)분광 측정으로">분광측정으로 관찰하였다. 여기 광 파장에 따른 차이를 관측하기 위해 여기 광을 800 nm부터 900 nm까지 바꾸면서 측정하였다.
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후)엽록 소">엽록소 형광 스펙트럼 측정에는 시스템의 분광측정기능을 사용하였다.
엽록소의 이광자현미경 영상촬영에서 여기 광 변화에 따른 엽록소 형광 스펙트럼의 변화와 같은 영역에서 이광자현미경 영상 촬영을 계속 진행하였을 때 형광 스펙트럼에서의 반응을 관찰하였다. 849 nm 이하의 여기 광의 경우
후)이광자 현미경으로">이광자현미경으로 같은 엽록소 샘플을 연속 촬영하는 경우 펨토초 펄스 레이저 여기 광에 의해 엽록소의 스펙트럼이 변화하는 것이 기존 연구에서 관찰하였는 데 그 연구에서는 780 nm 파장의 여기 광으로 관찰하였다. 여기 광에 의한 영향은 흡수 스펙트럼과
후)6마이크론">6 마이크론 두께로 volume scan 하였고 이를 projection하여 1개 프레임으로 만들었다. 프레임 영상 데이터 분석에는 엽록체만을 분석하기 위하여 영상처리를 수행하였다(그림 1). 이는 여기 광의 파장이 짧을수록 백그라운드 신호가 강하기 때문에
후)형광광을">형광 광을 500 nm ~ 600 nm, 600 nm ~ 700 nm 2 채널로 나누어 분광 측정하였다. 기존의 연구에서
후)형광광을">형광 광을 프리즘을 통해 분광시키고 슬릿을 통해 10 nm 대역으로 신호를 집속하게 하였으며 이 슬릿을 선형이동하면서 10 nm 단위로 분광 영상을 반복해서 획득하였다. 각 영상의 신호로부터 그래프를 그리면
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 식물은 Arabidopsis thantalia로 petri dish에서 배양된 2주 자란 것을 사용하였고 잎을 촬영하였다. 촬영하기 전에는 20분 이상 어두운 곳에 두었다.
- 사용된 이광자현미경은 라이카 TCS SP5 II 시스템으로 단광자 형광 기반 공초점현미경과 이광자현미경 기능이 함께 포함되어있다.
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후)이광자 현미경을">이광자현미경을 상호 비교할 수 있었다. 사용한 여기 광 파장은 공초점현미경의 경우 488 nm를 사용하였고, 이광자현미경의 경우 800 nm에서 1000 nm까지 50 nm 간격으로 바꿔가며 측정하였다. 사용한 실험조건은 대물렌즈의 아래로 평균 20 mW 파워,
성능/효과
- 결론적으로 이광자현미경 여기광을 850 nm, 900 nm 등 장파장으로 사용하여 arabidopsis thaliana를 촬영한 경우, 단파장 여기광에 비하여 촬영깊이에서는 차이가 없었으나 이광자 형광 광 스펙트럼에서는 차이가 있었다. 후)신호세기가">신호 세기가 점차 증가하는 것이 약 870 nm 여기 광 파장까지 보였으며 900 nm 여기 광에서는 변화가 나타나지 않았다. 반면에 600 ~ 700 nm 장파장 대역에서는 849 nm 이하 여기 광에서는 신호가 급격히 증가하다가 천천히 감소하는 경향이 보이고 850 ~ 870 nm 대에서는 초기에 감소했다가 증가 후 일정하게 유지가 되는 경향, 마지막으로 900 nm 대에서는 신호가 점차 감소하는 경향이 보였다. 특히 900 nm 대에서는 전반적인 후)단파장대역에서는">단파장 대역에서는 신호가 피크에 도달한 뒤 천천히 감소하기 시작했고 장파장 대역에서는 좀 더 긴 시간 후에 피크에 도달하는 것이 보였다. 여기 광 파장이 850 nm, 870 nm, 900 nm 로 길어질수록 단파장 대역에서는 신호 증가 기울기가 점차 낮아졌고 900 nm에서는 신호가 일정하게 유지되었으며 반면에 장파장 대역에서는 850 nm와 870 nm 여기 광 파장에서는 신호가 초기에 감소하다가 상승하는 패턴이 보이다가 900 nm에서는 신호가 점차 감소하는 것이 나타났다. ">포함되어있다. 이를 활용하여 공초점현미경과 이광자현미경을 상호 비교할 수 있었다. 사용한 여기 이는 단광자 여기에 의한 형광 스펙트럼 피크와도 차이가 난다. 이와 같은 이광자 형광 광 스펙트럼 피크 변화는 여기 광 파장이 849 nm에서 850 nm로1 nm 차이에서도 발생하는 것이 관측되었다.
질의응답
핵심어 질문 논문에서 추출한 답변 레이저 스캐닝 현미경이 식물 동작 원리 이해에 중요한 이유는? 레이저 스캐닝 현미경은 식물 잎 줄기 등을 3차원 고해상도 영상화 할 수 있고 식물 내 세포 및 소기관을 관찰할수 있어 식물의 동작 메커니즘 이해에 중요하다. 식물의 고해상도 3차원 영상에는 주로 공초점 레이저 스캐닝 현 미경(confocal laser scanning microscopy, CM)이 활용되 었다[1-2]. 이광자현미경의 활용도가 식물에서는 높지 않은 이유는? 반면에 식물에서는 이광자현미경의 활용도가 그리 높지는 않다. 식물은 조직 내부가 공기층을 포함하며 훨씬 더 불균질하여서 광수차와 광산란이 높게 발생하며, 엽록소 등이 여기 광을 흡수하여 광흡수도 높다. 그러므로 공초점현미경 보다 장파장의 여기 광을 사용하는 이광자현미경이 촬영깊이 면에서 장점이 크지 않다. 또한 이광자현미경에서 이광자 여기에 사용하는 펨토초 레이저는 엽록소에 높은 여기 광 플럭스에 의해 광손상을 더 많이 발생시키는 것으로 알려져 있다[10]. 하지만 그럼에도 불구하고 이광자 현미경은 단광자 형광 기반 공초점현미경에 비해 식물에서 상대적으로 더 높은 촬영 깊이를 보였으며 in vivo 연구에도 활용되었다. 식물의 고해상도 3차원 영상에는 무엇이 활용되었나? 레이저 스캐닝 현미경은 식물 잎 줄기 등을 3차원 고해상도 영상화 할 수 있고 식물 내 세포 및 소기관을 관찰할수 있어 식물의 동작 메커니즘 이해에 중요하다. 식물의 고해상도 3차원 영상에는 주로 공초점 레이저 스캐닝 현 미경(confocal laser scanning microscopy, CM)이 활용되 었다[1-2]. 공초점 현미경은 단광자 형광을 기반으로 식물소기관의 자가형광이나 외부 형광체를 이용하여 관심있는 분자체를 형광 염색하여 영상 관찰하는 연구에 많이 사용되었다. 참고문헌 (17)
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