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문제 정의
- 으로 구성되어 있는 처방으로 현재 동신대학교 한방병원에서 고지혈증에 활용되고 있다. 이에 임상적으로 혈중 지질이 감소하는 효과를 나타내는 枸杞子加味方에 대하여 실험적으로 규명하고, 기전을 밝히고자 연구하게 되었다.
- 이에 저자는 枸杞子加味方 추출물을 Raw 264.7 cell을 이용하여 세포독성, DPPH 소거능, No 생성 억제, ROS 활성효과를 측정하고, 고지혈증 질환모델동물인 6주령의 수컷 ApoE(k/o) 생쥐를 이용하여 간 및 신 독성, 혈중 인자 등을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 임상적으로 혈중 지질이 감소하는 효과를 나타내는 枸杞子加味方에 대하여 실험적으로 규명하고, 기전을 밝히고자 연구하게 되었다.
제안 방법
- 3. Research Diet, USA)와 물을 자유롭게 공급하면서 항온(25±2 ℃), 항습(50±5%) 및 12시간 간격의 광주기(light on 07:00-19:00)로 명암이 조절되는 SPF(Specific Pathogen Free) 실험실에서 실험하였다.
- Cholesterol 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 혈청 내 Total Cholesterol, LDL cholesterol, HDL cholesterol, Triglyceride를 측정하였다.
- 3). GGB의 항산화 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 DPPH 소거활성능, NO 생성능, ROS 생성능을 조사하였다. DPPH는 그 자체가 매우 안정한 free radical로서 proton-radical scavenger에 의해 탈색되어 항산화활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 장점 때문에 항산화 물질을 검색하는데 많이 이용되고 있다41.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. Raw 264.
- N1 buffer 50 μl를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소 반응 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
- 枸杞子加味方이 고지혈증에 대한 효과 및 항산화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 고지혈증 질환 모델 동물인 6주령 수컷 ApoE(k/o) 생쥐에 경구투여한 후, in vitro에서는 세포독성, 항산화 활성측정, in vivo에서는 간 및 신 독성, 혈중지질 인자, 간 조직의 효소활성을 측정 및 간 조직의 cholesterol 인자발현에 미치는 영향 등을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 각 실험군은 정상군, 대조군 그리고 GGB 50, 100, 200, 400 투여군으로 나누어 정상군은 일반 사료와 식수를 충분히 공급하였다 대조군과 GGB 투여군은 Table 3의 조성으로 만들어진 고콜레스테롤 사료와 식수를 충분히 공급하였으며, GGB 투여군은 고콜레스테롤 사료 투여 2주 후부터 400 mg/kg/0.5 ml의 양으로 정해진 시간(오전 11시)에 매일 투여하였다.
- 배양 종료 후 DCFH-DA 10 μM을 처리하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 배양한 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심 분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 μl를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 ROS를 측정하였다.
- 7 cells은 96well plates에 104 cells/well 로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, GGB를 각각 50, 100, 200 ug/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10 ul의 WST solution을 첨가한 후 CO2 배양기(37 ℃, 5% CO2)에서 30분 반응 시킨 후, 450 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시 하였다.
- 실험 종료 후 혈액을 채취 해 혈청을 분리하여 Alanine aminotransferase(ALT), Alkaline Phosphatase (AST), 요소질소(BUN) 등의 검사를 실시하였다.
- 실험 종료 후, ApoE(k/o) 생쥐에서 심장 천자를 통하여 채혈한 후 Total cholesterol 및 HDL(Highdensity lipoprotein), LDL(Low-density lipoprotein), triglyceride 함량을 바이오톡스텍(오창, Korea)에 측정 의뢰하였다.
- 6 mm, 5 μm)을 사용하였다. 이동상은 water(A)와 acetonitrile(B) 로 gradient elution system을 적용시켜 0%(5분 B), 0-30%(35분 B), 30-100%(10분 B)로 설정하였다. 유속은 1.
- 이에 저자는 枸杞子加味方 추출물을 Raw 264.7 cell을 이용하여 세포독성, DPPH 소거능, No 생성 억제, ROS 활성효과를 측정하고, 고지혈증 질환모델동물인 6주령의 수컷 ApoE(k/o) 생쥐를 이용하여하여 간 및 신 독성, 혈중 인자 등을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 제작된 블럭은 박절기(microtome)를 이용하여 3~4 μm 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline & eosin(H&E) 일반 염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다(Fig. 1).
- 각 실험군 별로 적출한 간 조직 10% 중성 포르말린에 48시간 고정하여 고정이 완료된 각 조직들은 흐르는 수돗물에서 12시간 수세하여 조직 내 고정액을 완전 제거하였다. 조직의 탈수를 위해 60%에서부터 100% 알코올에 이르기까지 농도 상승 순으로 통상의 방법에 따라 탈수하고, xylene에 투명과정을 거친 다음 파라핀 블럭을 제작하였다. 제작된 블럭은 박절기(microtome)를 이용하여 3~4 μm 두께로 절편을 만들어 탈 파라핀 및 함수 과정을 거친 다음 hematoxyline & eosin(H&E) 일반 염색을 실시하여 광학현미경상에서 관찰 및 사진 촬영 하였다(Fig.
대상 데이터
- Dulbecco's phosphate buffered saline, RPMI 1640, Collagenase A, Penicillin, pyrogallol, Ethylenediaminetetraaㄹcetic acid (ETDA), 3-(4,5- Dimethyl -2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT), Sodium citrate, N-2-hydroxylethyl -piperazine-N-2-ethane sulfonic acid(HEPES), lipopolysaccaride(LPS), 2,7-dichloro-dihydro fluorescin diacettate(DCFH-DA), diethyl pyrocarbonate(DEPC), 2,2Diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)는 sigma사(USA) 제품을, Dimethyl sulfoxide(DMSO)는 Sowa chemical 사(Japan) 제품을, Ethylacrtate 는 Junsei사(Japan) 제품을, Potassium Phosphate Monobasic(KH2PO4) 는 Yakuri사(Japan) 제품을, RNAzolB M-MLV RT, dNTPs mix, RNase inhibitor Takara사(Japan) 제품을, First Strand cDNA Synthesis kit는 Pharmacia 사(USA) 제품을, DNase I는 Life Technologies사(USA) 등을 사용하였고, 이 밖에 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- HPLC는 Shimadzu(Japan) 사의 system controller(CBM-20A), pump(LC-20AD), column oven(CTO-20A), UV/VIS detector(SPD-20A) 를 사용하였으며, column은 ACE 5 C18(250×4.6 mm, 5 μm)을 사용하였다.
- Raw 264.7 cell 내에서 reactive oxygen species (ROS)를 측정하기 위하여 2',7'-Dichlorodihydrofluorescin diacetate(DCFH-DA)를 이용하였다.
- 본 실험에 사용한 枸杞子加味方 (Gugijagami-bang, GGB)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입하여 정선한 후 사용하였다. 한첩 분량은 아래와 같다(Table 1).
- 본 연구에 사용된 기기는 High performance liquid chromatography(HPLC. Shimadzu Japan), Ice-maker (Vision, Korea), Centrifuge(Hanil Co., Korea), Rotary vaccum evaporator(Büchi 461, Switzerland), Deep freezer(Sanyo Co., Japan), Autoclave(Sanyo, Japan), Ultrasonic cleaner(Branson Ultrasonics Co., USA), ELISA reader(Molecular Divice., USA), Roller Mixer (Gowon scientific technology Co., Korea), 한약유출기(DWP-1800T, 대웅, Korea), Spectrophotometer (UV-2450, Shimazu, Japan), cell cytometery(FACS, Beckman Co., USA), Balance(Cass, korea), 생화학기(AU400, Olimpus, USA), 감마카운터기(WIZARD 1470, Finland) 등을 사용하였다.
- 실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- Significant value was calculated by compared with control group by ANOVA multi t-test (* p<0.05).
- Significant value was calculated by compared with control group by ANOVA multi t-test (** p<0.01, *** p<0.001).
- 본 실험에서 얻은 결과를 ANOVA multi t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였다. 각 대조군을 정상군과, 실험군을 대조군과 비교하여 p<0.
이론/모형
- Cells were treated with 50, 100, 200 μg/ml of Caesalpinia sappan Lignum for 24hrs. Cell viability was determined using the WST assay. The results are expressed as mean±SD from three independent experiments.
성능/효과
- 1. 枸杞子加味方은 in vitro에서 세포독성은 없었으며, DPPH 소거활성능을 농도 의존적으로 증가시켰고, 대조군에 비해 NO 생성량(%), ROS 생성량(%)은 유의성 있게 감소시켰다.
- 2. 枸杞子加味方은 in vivo에서 혈청 내 Total Cholesterol 과 LDL cholesterol, TG를 유의성 있게 감소시켰으나, HDL cholesterol을 증가시켰으나 유의성은 없었다.
- 3. 枸杞子加味方은 조직검사 상 지방간(hepatic steatosis) 이 억제되어 간에 원형의 지방(fat)이 거의 사라진 상태가 관찰되었다.
- DPPH의 소거 활성은 25, 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서 각각 8.2±4.5, 22.5±5.0, 44.3±5.2, 76.5±3.4 (%)로 나타나 농도 의존적으로 소거활성이 증가 하는 것으로 확인되었고(Fig. 4), Raw 264.7 세포에서 NO의 생성량(%)을 측정한 결과, 대조군을 100.0±8.7%로 나타냈을 때 정상군은 27.7±12.7%, GGB50은 101.8±3.1%, GGB100은 86.8±7.5%, GGB200은 62.5±3.1%로 나타나 GGB100군과 GGB200에서 유의성 있는 감소를 나타내었고(Fig. 5), Raw 264.7세포에서 ROS의 생성량(%)을 측정한 결과, 대조군을 100.0±0%로 나타냈을 때 정상군은 34±18%, GGB50은 90±9%, GGB100은 86±12%, GGB200은 75±8%로 나타나 GGB200에서 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 6).
- DPPH의 소거 활성은 25, 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서 각각 8.2±4.5, 22.5±5.0, 44.3±5.2, 76.5±3.4 (%)로 나타나 농도 의존적으로 소거활성이 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 4).
- GGB 메탄올 추출물을 HPLC로 pattern 분석한 결과 254 nm에서 retention time이 16.7분, 22.7분, 24.1분, 26.4분대에 peak를 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- GGB의 안전성 검증을 위하여 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성을 관찰한 결과 대조군의 세포생존율 100±0%로 했을 때, GGB의 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서는 각각 132±5, 130±6, 130±6(%)의 세포 생존율을 보여 세포 독성이 없는 것으로 생각된다(Fig. 3).
- LDL cholesterol의 변화는 정상군이 13.3±4.1(mg/dl), 대조군이 1541.7±69.3(mg/dl), GGB400 투여군은 1219.3±57.3(mg/dl)으로 나타나 GGB400 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 10).
- Triglyceride의 변화는, 정상군이 88.3±44.5(mg/dl), 대조군이 348.0±80.2(mg/dl), GGB400투여군은 228.3±29.5(mg/dl)으로 나타나 GGB400 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 12).
- 간 독성평가 요소인 AST와 ALT를 측정한 결과 AST는 정상군이 80.3±15.0(I.U/L), 대조군이 118.5±15.0(I.U/L), GGB 400투여군이 104.3±11.4(I.U/L) 로 나타났으며, ALT는 정상군이 30.2±3.7(I.U/L), 대조군이 140.0±14.1(I.U/L), GGB400 투여군이 37.7±14.0(I.U/L)로 나타나 대조군에서는 증가했으며 GGB 투여군에서는 대조군보다 감소되어 GGB가 AST, ALT 수치를 감소시키는 작용이 있는 것으로 추정 되며, 약물에 대한 간독성은 없을 것으로 생각된다(Fig. 7).
- 대조군을 100.0±0%로 나타냈을 때, 정상군은 34±18%, GGB50은 90±9%, GGB100은 86±12%, GGB200은 75±8%로 나타나 대조군에 비해 실험군에서 농도 의존적으로 감소하였으며, 특히 GGB200에서 유의성 있는(* p<0.05) 감소를 나타내었다(Fig. 6).
- 대조군을 100.0±8.7%로 나타냈을 때, 정상군은 27.7±12.7%, GGB50은 101.8±3.1%, GGB100은 86.8±7.5%, GGB200은 62.5±3.1%로 나타나 GGB100과 GGB200에서 유의성 있는(** p<0.01, *** p<0.001) 감소를 나타내었다(Fig. 5).
- 실험 종료 후 간을 적출하여 염색한 결과 대조군에서는 간세포에서 지방질 축적에 의한 광범위한 지방공포인 흰색 원형조직이 많이 분포하여 전형적인 지방간 모습(화살표) 병변 소견이 나타나 있으며 세포핵이 줄어든 반면, GGB 400에서는 대조군에 비하여 지방간(hepatic steatosis)이 억제되어 간에 원형의 지방(fat)이 사라진 상태가 관찰되었다(Fig. 13).
- 실험 종료 후 혈청 내 Total Cholesterol의 변화는 정상군이 116.8±7.6(mg/dl), 대조군이 1929.0±12.9 (mg/dl), GGB400 투여군은 1575.5±132.9(mg/dl)으로 나타나 GGB400 투여군에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(Fig. 9).
- 이상의 결과들을 종합해 보면, 枸杞子加味方은 세포독성 및 간, 신 독성은 없었으며, DPPH 소거활성능을 농도 의존적으로 증가시켰고, NO 생성량 (%), ROS 생성량(%)은 유의성 있는 감소시키는 효과가 있는 것으로 보아 枸杞子加味方은 항산화 효과가 있음을 알 수 있었고, Total Cholesterol과 LDL cholesterol, TG를 감소시키는 것으로 보아枸杞子加味方이 혈중 지질의 농도를 감소시키는 효과가 있음을 알 수 있었다. 또한 조직검사 상 간 조직을 보호하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 정상군의 세포생존율 100±0%로 했을 때, GGB의 50, 100, 200(μg/ml) 농도에서는 각각 132±5, 130±6, 130±6(%)로 나타났다(Fig. 3).
- 정상군이 88.3±44.5(mg/dl), 대조군이 348.0±80.2 (mg/dl), GGB400은 228.3±29.5(mg/dl)으로 나타나 GGB400에서 대조군에 비하여 유의성 있는(* : p<0.05) 감소를 나타내었다(Fig. 12).
- 조직학적 검사 결과, 대조군에서는 간세포에서 지방질 축적(hepatic eatosis)에 의한 광범위한 지방공포인 흰색 원형조직이 많이 분포하여 전형적인 지방간 모습의 병변 소견이 나타나 있으며 세포핵이 줄어든 반면, GGB 400 mg/kg 투여군에서는 대조군에 비하여 지방간(hepatic steatosis) 이 억제되어 간에 원형의 지방(fat)이 거의 사라진 상태가 관찰되었다(Fig. 13). 따라서 GGB가 간 조직을 보호하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 이러한 결과는 枸杞子加味方이 임상에서 고지혈증으로 야기되는 동맥경화, 허혈성 심질환, 기타 심혈관질환의 예방과 치료에 효과가 있을 것으로 사료되며 향후 보다 지속적이고 심도 있는 연구가 필요하리라 사료된다.
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