[논문]담배가루이(Bemisia tabaci )에서 분리한 곤충병원성진균의 동정 및 병원성 검정

박현로; 류영현; 연일권; 남성희; 김동근; 한명세

doi:10.5656/ksae.2013.09.1.081

담배가루이(Bemisia tabaci )에서 분리한 곤충병원성진균의 동정 및 병원성 검정
Identification and Characterization of Entomopathogenic Fungi Isolated from Bemisia tabaci in Korea 원문보기

한국응용곤충학회지 = Korean journal of applied entomology, v.53 no.1, 2014년, pp.27 - 34

박현로 (경상북도농업기술원) , 류영현 (경상북도농업기술원) , 연일권 (경상북도농업기술원) , 남성희 (농촌진흥청 국립농업과학원 농업생물부 곤충산업과) , 김동근 (경상북도농업기술원) , 한명세 (경북대학교 농업생명대학 천연섬유학과)

초록
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자연 감염된 담배가루이로부터 곤충병원성진균을 분리 동정하고, 이 균주에 대하여 배양특성, 자연발병 요인, 그리고 주요 온실해충인 담배가루이, 점박이응애, 대만총채벌레에 대한 살충력을 검정하였다. 분리 균주의 형태적 특성은 직립한 분생자병에 윤생으로 호리병 형태의 4-6개 phialide를 지녔고, 분생포자의 크기는 $3.0-3.4{\mu}m$ 이었다. 분리 균주의 rDNA의 ITS영역 염기서열 분석에서 Isaria fumosorosea (AF461747)와는 99%의 높은 염기서열 유사도를 보였다. Potato dextrose agar, Sabouraud maltose agar+yeast extract 그리고 Sabouraud dextrose agar+yeast extract 배지에서 IFs 균주는 $24^{\circ}C$의 SDAY 배양에서 균사 성장이 가장 양호하였으며, $15^{\circ}C$보다는 $35^{\circ}C$의 고온에서 균사 성장이 좋았다. I. fumosorosea IFs-08, -09 균주는 담배가루이에 대하여 각각 96.7, 93.9%의 높은 살충율을 보였으며, 점박이응애(92.0, 84.9%) 그리고 대만총채벌레(84.4, 81.5%)에서도 80-90%정도의 살충율을 보인 반면 KACC로부터 분양받은 Isaria tenuipes, Isaria farinosa, Isaria fumosorosea 균주들은 10-20% 내외의 낮은 살충율을 나타내었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Entomopathogenic fungi were isolated from Bemisia tabaci in an Oriental melon field, and their growth characteristics, factors related to a natural outbreak, and infectivity against Bemisia tabaci, Tetranychus urticae, and Frankliniella intonsa were investigated. The isolates had erect conidiophores bearing whorls of 4-6 phialides with a swollen base where cylindrical conidia of $3.0-3.4{\mu}m$ were attached. The isolates were identified as Isaria fumosorosea on the basis of morphological characteristics and an ITS sequence with 99% similarity. I. fumosorosea IFs-08 grew well on Sabouraud dextrose agar+yeast extract medium(3.2 mm/day/$24^{\circ}C$); it grew better at $35^{\circ}C$ than at $15^{\circ}C$. The isolates of I. fumosorosea-IFs were highly infective and killed 93.9-96.7% B. tabaci, 84.9-92.0% T. urticae, and 81.5-84.4% F. intonsa in bioassay, whereas three isolates (Isaria tenuipes, Isaria farinosa, and Isaria fumosorosea) from KACC showed a low infectivity of 10-20%. To the best of our knowledge, this is the first report of I. fumosorosea isolated from B. tabaci in Korea.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

PDA배지에서 7일 동안 배양한 IFs-08 (Isaria fumosorosea) 균주를 직경 3 mm로 자른 후 PDA, SDAY (Sabouraud dextrose agar + yeast extract, Difco, USA; dextrose 40 g, casein 10 g, agar 15 g, yeast extract 2 g/L), SMAY (Sabouraud maltose agar + yeast extract, Difco, USA; maltose 40 g, casein 10 g, agar 15 g, yeast extract 2 g/L) 배지에 접종한 다음 15, 20, 24, 27, 그리고 35℃의 생장상에서 암조건으로 14일 동안 배양하여 균사체의 성장 및 직경을 6plate 3회, 3반복으로 조사하였다.
SEM시료 제작은 배지를 5 × 5 mm 크기로 자른 후 Karnovsky 용액에 고정시킨 다음 0.05M Cacodylate 완충액으로 10분 동안 3회 세척하고, 1% Osmic Acid로 120분 동안 2차 고정하였으며, 고정된 시료는 다시 0.05 M Cacodylate 완충액으로 10분 동안 3회 세척한 다음 50, 75, 90, 95, 100%의 ethanol로 각각 40분간 탈수하고 amylacetate로 치환하여 critical point dryer로 건조한 후에 gold-palladium으로 coating 한 다음 주사전자현미경(HITACH S-2460N, Japan)으로 관찰하였다.
5 cm, mesh로 씌움)이 있는 깊은 아크릴 용기에 이식하여 접종함으로서 활동이 왕성한 개체의 이탈을 방지할 수 있었다. 감염 판단은 해충 표피에 균사체로 덮여 있거나몸체가 탈수되어 갈색으로 변한 모습이 관찰될때를 기준으로 하였다. 모든 실험은 2회 3반복으로 수행하였고, 치사율은 2회 3반복의 평균값으로 나타내었다.
균주 분리는 이병된 담배가루이 개체를 70% 에탄올에서 5～10초간 침지 소독한 후 멸균 증류수로 2회 세척한 다음 필터 페이퍼 위에서 건조 후 세절하였고, SDA (Sabouraud dextrose agar, Difco, USA; dextrose 40 g/L, casein 10 g/L, agar 15 g/L)를 기본으로 한 배지에 2 g/L의 yeast extract (Difco, USA)와 200 mg의 streptomycin, 100 mg의 tetramycin을 첨가하여 제조한 배지 위에 미리 준비된 세절 시료를 놓은 후 7일간 배양하여 균사체를 1차 분리하였다. 분리된 균주는 PAD (Potato dextrose agar, Difco, USA) 배지상에 다시 이식한 후 24±1℃에서 14일 동안 배양하였다.
담배가루이가 대발생한 경북 성주의 참외 시설재배지를 중심으로 담배가루이에 대한 토착 곤충병원성진균을 수집하기 위하여 2008년부터 2009년까지 현지 조사를 실시하였다. 조사 중 곤충병원성 진균에 집단 감염된 담배가루이를 발견하고 자연발병 원인, 균주 동정 및 생육특성 그리고 분리된 균주의 주요해충에 대한 기주범위를 조사하였다.
담배가루이에서 분리한 곤충병원성 진균인 IFs-08, -09 균주에 대하여 ITS 염기서열을 분석하였다. 분석한 ITS 영역의 염기서열을 NCBI의 GenBank에 수록된 DNA 염기서열database에 검색한 결과 IFs-08과 IFs-09 균주는 phylogenetic tree 상에서 I.
모든 균주는 PDA배지에서 각각 계대 배양한 colony를 SDAY 배지에 이식하고, 24±1℃, 14/10시간(명/암) 조건으로 2주 동안 배양 후 포자를 수확하였다.
감염 판단은 해충 표피에 균사체로 덮여 있거나몸체가 탈수되어 갈색으로 변한 모습이 관찰될때를 기준으로 하였다. 모든 실험은 2회 3반복으로 수행하였고, 치사율은 2회 3반복의 평균값으로 나타내었다.
분무 처리한 잎의 개체 이탈과 2차 오염방지, 습도유지(>90% RH)를 위하여 잎 양면에 납작한 평량 플라스틱 디쉬(9 × 9 × 1cm)로 씌워 고정하고 처리 후 7일 동안 매일 이동식 디지털 현미경(ViTiny, VT-101, Taiwan)으로 곰팡이 감염 개체 유무를 관찰하였다.
수집한 IFs 곤충병원성진균과 KACC로부터 분양받은 1속 3종을 이용하여 담배가루이(Bemisia tabaci), 점박이응애(Tetranychus urticae), 대만총채벌레(Frankliniella intonsa)의 각 2～3령 약충을 대상으로 살충력검정을 수행하였다. 해충은 아크릴로 제작한 40 × 90 × 40 cm의 사육용기 내에서 1개월 정도 키운 참외의 잎에 담배가루이와 점박이응애 성충을 방사하고 산란을 유도한 후에 3일이 지나서 방사한 성충을 제거하고 24±1℃, 16/8시간(명/암) 조건으로 실내 곤충사육실에서 사육하였다.
담배가루이가 대발생한 경북 성주의 참외 시설재배지를 중심으로 담배가루이에 대한 토착 곤충병원성진균을 수집하기 위하여 2008년부터 2009년까지 현지 조사를 실시하였다. 조사 중 곤충병원성 진균에 집단 감염된 담배가루이를 발견하고 자연발병 원인, 균주 동정 및 생육특성 그리고 분리된 균주의 주요해충에 대한 기주범위를 조사하였다.
, 1990), PCR은 Mygenie Thermal Block (BioNeer, Korea) 기기를 이용하여 반응시켰다. 증폭반응은 initial denaturation이 94℃에서 4분간, 그리고 30 cycle의 94℃에서 60초간 denaturation과정으로, annealing 온도는 56℃에서 40초간, extension은 72℃에서 70초로 하였으며, 이 후 72℃에서 10분간 잔여 합성반응을 실시하였다. 이렇게 얻어진 PCR 증폭물은 2% agarose gel에서 전기영동하여 예상되는 크기의 PCR 산물을 잘라낸 후 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제하였다.
해충은 아크릴로 제작한 40 × 90 × 40 cm의 사육용기 내에서 1개월 정도 키운 참외의 잎에 담배가루이와 점박이응애 성충을 방사하고 산란을 유도한 후에 3일이 지나서 방사한 성충을 제거하고 24±1℃, 16/8시간(명/암) 조건으로 실내 곤충사육실에서 사육하였다.
형태적 관찰에 사용된 균주는 7～14일 동안 배양한 것으로 하였으며, 균사, 분생자병, 분생포자, 분생자경, 경자, 분생자병속 등을 위상차현미경(OLYMPUS AX70, Japan)과 주사전자현미경(SEM)을 이용하여 제작된 10여개 시료를 2회 3반복으로 관찰하였다. SEM시료 제작은 배지를 5 × 5 mm 크기로 자른 후 Karnovsky 용액에 고정시킨 다음 0.

대상 데이터

대만총채벌레는 아크릴 사육용기(7 × 7 × 20 cm, SPL)에 이식한 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus)에서 담배가루이와 동일한 조건으로 사육한 후에 2～3령 약충이 된 것을 검정에 사용하였다.
본 연구에 사용된 곤충병원성 진균은 2008년 9월 경북 성주군 대가면(위도 35° 53′10.96″N, 경도 128° 11′64.10″E) 참외 시설재배지와 2009년 11월 경북 성주군 대가면 성주과채류시험장(위도 35° 52′45.25″N, 경도 128° 10′38.65″E) 가지 시설재배지에서 자연 감염된 담배가루이(Bemisia tabaci) 개체(Fig. 1-A)로부터 수집하였다.
수집한 기주 잎은 비닐 팩에 넣은 후 즉시 실험실로 운반하고, –20～5℃ 저장고에 보관하면서 균주 분리에 사용하였다. 집단 자연발병의 시기와 원인 분석을 위하여 농촌진흥청 농업기상정보 서비스 자료(2008. 9. 1～9. 30, 성주)를 이용하였으며, 또한 현지 농가의 재배기술에 대한 문답 조사를 수행하였다.

데이터처리

이렇게 얻어진 PCR 증폭물은 2% agarose gel에서 전기영동하여 예상되는 크기의 PCR 산물을 잘라낸 후 Gel Purification Kit (Bioneer, Korea)로 정제하였다. 결정된 염기서열은 Clustal X (version1.81)로 정열한 후 neighbor joining method으로 genetic distance values를 결정하였으며, Treeviews (version32.0) 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 구성하였다.

이론/모형

2. A phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of ITS 5.8S DNA and 28S DNA regions of Isaria fumosorosea IFs-08, IFs-09, and Lecanicillium lecanii LLs-09 by using the neighbor-joining method.

성능/효과

0001)에 따라 차이가 있었다. I. fumosorosea IFs-08, IFs-09 균주는 처리 후 7일 동안 각각 96.7, 93.9%의 치사율을 보였으며, KACC로부터 분양받은 I. fumosorosea, I. farinosa, I. tenuipes 균주는 각각 20% 정도의 낮은 치사율을 나타내었다. 점박이응애에 대한 치사율도 담배가루이와 마찬가지로 균주별 차이가 있었다(PROC GLM; F=107.
0001). IFs-08과 IFs-09 균주는 각각 92.0, 84.9%의 치사율을 보였고, 분양받은 나머지 균주들은 10～20% 정도의 낮은 치사율을 나타내었다. 대만총채벌레에 대한 살충율은 IFs-08과 IFs-09 균주가 각각 84.
담배가루이에서 분리한 곤충병원성진균은 Isaria fumosorosea로 동정되었다. 곤충병원성 진균의 형태학적 분류는 기주종류, 분생자병속의 형태, 분생포자의 발생 형태 등이 기준이 되는데(Humber, 1997), 성주 담배가루이에서 분리된 균주는 균사가 투명하고 격막이 있으며, 폭은 2.
대만총채벌레에 대한 살충율은 IFs-08과 IFs-09 균주가 각각 84.4, 81.5%이었으며, 나머지 균주들은 10～20%의 낮은 살충율을 보였다(PROC GLM; F=84.86; df=5,12; Pr>F=<0.0001) (Fig. 4).
3). 동일한 온도에서 배지별 균사체의 성장은 SDAY 배양에서 가장 양호하였으며(3.2 mm/day/24℃), 다음으로 SMAY, PDA순 이었다. 온도별 성장은 24℃에서 가장 양호하였으며, 다음으로 27, 20℃ 순이었고, 15℃보다는 고온의 35℃에서 균사 성장이 좋았다.
, 2006)에 대하여 병원성이 있는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 수집한 I. fumosorosea-IFs 균주도 이상의 3종 해충에 대하여 높은 병원성이 확인되었고, 분리 균주와 특정 해충 간에 기주 특이성 혹은 균주에 따라 감염 기주의 스펙트럼이 다양하게 나타났다. I.
본 연구에서 집단 발병의 원인을 분석한 결과 수집 전 일주일 동안의 기상이 평상시 평균기온 보다 5～10℃정도 낮았으며, 80%정도의 높은 상대습도와 3-4일간 흐린 날이 지속됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4). 이는 Carruthers 등(1993), Lacey 등(1993, 1996) 그리고 Castineiras(1995)이 높은 습도와 흐린 날씨, 낮은 기온이 지속되면 자연 집단 발생할 수 있다는 보고와 거의 일치하는 기상 상황(9월 23일～9월 26일)이었다.
담배가루이에서 분리한 곤충병원성 진균인 IFs-08, -09 균주에 대하여 ITS 염기서열을 분석하였다. 분석한 ITS 영역의 염기서열을 NCBI의 GenBank에 수록된 DNA 염기서열database에 검색한 결과 IFs-08과 IFs-09 균주는 phylogenetic tree 상에서 I. fumosorosea 계통군에 속하는 균주임이 확인되었으며, 특히 I. fumosorosea (AF461747)와는 99%의 높은 염기서열 유사도를 보임에 따라 이들 2균주는 상기의 형태학적 특징과 계통학적 유연관계를 기준으로 볼 때 Isaria fumosorosea로 동정되었다(Fig. 2).
2 mm/day/24℃), 다음으로 SMAY, PDA순 이었다. 온도별 성장은 24℃에서 가장 양호하였으며, 다음으로 27, 20℃ 순이었고, 15℃보다는 고온의 35℃에서 균사 성장이 좋았다. PDA배지에서 IFs 균주의 배양속도는 2.
fumosorosea 균주가 온대지역에서 수집한 균주보다 고온에서 균사 성장이 양호하다고 하였다. 이번에 분리된 IFs 균주는 참외 시설재배지에서 분리한 때문인지 저온 내성을 지닌 일반적인 I. fumosorosea 균주(Vidal et al., 1997a)에 비해 비교적 고온에 적응된 것으로 추정된다. 균주의 온도 내성은 생물적 방제원의 중요한 요소로서 작용하며, 적용 장소의 온도에 따라 방제 능력이 좌우되기 때문에 적용 장소에 적합한 온도 내성을 지닌 균주를 확보하는 것이 중요할 것이다.

후속연구

fumosorosea-IFs 균주도 이상의 3종 해충에 대하여 높은 병원성이 확인되었고, 분리 균주와 특정 해충 간에 기주 특이성 혹은 균주에 따라 감염 기주의 스펙트럼이 다양하게 나타났다. I. fumosorosea IFs-08, 09 균주는 주요 3종 해충에 대하여 80～90%의 높은 병원성을 보임에 따라 이들 균주는 국내 성주지역 환경에 적응된 고병원성 토착균주가 아닌지 추정해 보며, 특히 3～4월에 성주 참외시설재배지는 부직포를 씌워 온도를 관리하기 때문에 내부 습도가 높고, 담배가루이가 발생하는 시기이므로 초기 방제가 중요한 이 시기에 I. fumosorosea IFs 균주를 살포하면 성주 참외 시설 재배지에서 담배가루이의 생물적 방제도 가능할 것으로 기대된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	담배가루이는 언제 최초로 보고되었는가?	담배가루이는 노린재목(Hemiptera)의 가루이과(Aleyrodidae) 에 속하는 해충으로 1889년 그리스에서 처음 보고되었다. 이 해충은 목화, 유채, 박과, 가지과 등 약 900종 이상의 광범위한 기주를 가지며(Goolsby et al.
	담배가루이는 어떤 해충인가?	담배가루이는 노린재목(Hemiptera)의 가루이과(Aleyrodidae) 에 속하는 해충으로 1889년 그리스에서 처음 보고되었다. 이 해충은 목화, 유채, 박과, 가지과 등 약 900종 이상의 광범위한 기주를 가지며(Goolsby et al.
	국내에 담배가루이는 언제 최초로 침입하였는가?	국내에는 1998년에 침입하였고, 2007년에는 경북지역의 참외와 토마토에서 대발생하여 생산량 감소와 품질 저하로 1,500억원 정도의 경제적 손실을 가져온 것으로 추정된다. 담배가루이 방제에는 후라니코티닐계의 합성농약을 주로 사용하고 있는데 이 약제의 지속적인 사용으로 약제 저항성 발달, 환경오염 등 여러 가지 문제점이 야기되고 있다.

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White, TJ., Bruns, T., Lee, S., Taylor. J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, in: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., White, T.J. (Eds.), PCR Protocols. a guide to methods and applications. Academic Press, New York. 315-322.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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