[논문]여주 활성 물질 Protocatechuic Acid의 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 개선 효과

최정란; 최지명; 이상현; 조계만; 조은주; 김현영

[국내논문] 여주 활성 물질 Protocatechuic Acid의 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 개선 효과
The Protective Effects of Protocatechuic Acid from Momordica charantia against Oxidative Stress in Neuronal Cells 원문보기

생약학회지, v.45 no.1 = no.176, 2014년, pp.11 - 16

최정란 (부산대학교 식품영양학과) , 최지명 (부산대학교 식품영양학과) , 이상현 (중앙대학교 식물시스템과학과) , 조계만 (경남과학기술대학교 식품과학부) , 조은주 (부산대학교 식품영양학과) , 김현영 (경남과학기술대학교 식품과학부)

Abstract ▼ AI-Helper

Protocatechuic acid is an active phenolic acid compound from Momordica charantia. In this study, we investigated the protective effect of protocatechuic acid against oxidative stress under cellular system using C6 glial cell. The oxidative stress was induced by hydrogen peroxide ($H_2O_2$) and amyloid beta 25-35 ($A{\beta}_{25-35}$), and they caused the decrease of cell viability and overproduction of reactive oxygen species (ROS). However, the treatment of protocatechuic acid significantly elevated the decreased cell viability and inhibited the overproduction of ROS by $H_2O_2$. In addition, protocatechuic acid significantly recovered the cellular damage induced by $A{\beta}_{25-35}$. In particular, protocatechuic acid at the concentration $10{\mu}g/mL$ decreased the elevated ROS level to normal level. These results indicate that protocatechuic acid may have neuroprotective effect through attenuating oxidative stress.

Keyword

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 실험에서는 신경교세포인 C6 glial cell에 H2O2와 Aβ25-35에 의해 유도된 산화적 스트레스로부터 여주에 함유된 protocatechuic acid 의 신경세포 보호효과를 연구함으로써 여주가 가지고 있는 phenolic acid 구성물질의 우수성과 천연 기능성 물질로서의 가능성에 대해 알아보고자 하였다.
오랜 전부터 ROS 검출에 사용되어지고 있는 DCF-DA는 세포막을 자유롭게 통과 할 수 있고 esterase에 의해 acetate group이 제거되어 세포 내에서 DCFH가 된다. 이 DCFH는 H₂O₂와 같은 ROS에 의해 산화되어 강한 형광성을 가지는 DCF가 되는 원리를³⁰⁾ 바탕으로 H₂O₂를 처리하여 C6 glial cell에서의 활성산소종 억제효과에 대해 알아보았다. ROS의 경우 정상적인 세포의 활동에 의해서 자연적으로 생성됨으로¹⁾ 시간이 지남에 따라 모든 군에서 ROS 생성량은 증가하지만 산화적 스트레스를 유도한 control군의 경우 초기에 생성된 ROS자체가 많은 것을 알 수 있다(Fig.
본 연구에서는 C6 glial cell을 이용하여 여주(Momordica charantia)의 활성물질인 protocatechuic acid의 산화적 스트레스에 의한 신경세포 보호효과에 대해 알아보았다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H₂O₂를 처리한 결과 protocatechuic acid는 모든 농도에서 유의적으로 세포생존율을 증가시켰으며, ROS생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다.

제안 방법

H₂O₂에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경 세포보호효과를 알아보기 위해 C6 glial cell을 이용하여 MTT assay를 시행하였다. 세포생존율 측정 결과, 정상군의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 H₂O₂를 처리한 control군의 경우 65.
35) 따라서 C6 glial cell에 Aβ25-35(25 µM)를 처리하여 산화적 손상에 대한 protocatechuic acid의 신경세포 보호 효과에 대해 알아보았다.
세포 부착이 잘 이루어지면 H2O2(100 µM)를 및 Aβ25-35(25 µM)를 처리하여 24시간 배양하여 산화적 스트레스를 유발 시킨 후 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양한 뒤 80 µM의 DCF-DA용액을 각 well에 주입하여 37℃에서 30분 동안 재배양 한 후 FLUOstar OPTIMA(BMG labtech, Ortenberg, Germany)에서 excitation-480 nm, emission-535 nm로 측정하였다.

대상 데이터

세포생존율과 ROS 생성률 측정을 위한 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dimethyl sulfoxide(DMSO)와 2'7'-dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)는 Sigma사 제품을 구입하였다.
산화적 스트레스를 유발 시키기 위한 H2O2는 Junsei(Junsei Chemical Co., Tokyo, Japan)사 제품을, Aβ25-35는 Sigma사 제품을 사용하였다.
세포 종류 및 시약 − 실험에 사용한 C6 glial cell은 한국 세포주은행(KCLB, Seoul, South Korea)에서 분양 받았으며 배양을 위한 100 units/mL의 penicillin streptomycin과 10% fetal bovine serum(FBS), Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) 배지(Welgene, Daegu, South Korea)를 사용하였다.
추출 − 여주 100 g을 메탄올로 추출하여 메탄올 추출물로 만들어 실험에 사용 하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 여주(Momordica charantia)는 함양(Hamyang, Korea)에서 구입하여 음건한 후 사용하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 여주(Momordica charantia)는 함양(Hamyang, Korea)에서 구입하여 음건한 후 사용하였다. 실험에 사용된 protocatechuic acid는 여주의 주요성분중의 하나이며,¹⁰⁾ Sigma(Sigma St. Louis, MO, USA)사 에서 추가 구입하여 실험에 사용하였다.

데이터처리

통계 분석 − 각 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, SAS 4.3을 이용하여 실험 결과로부터 ANOVA(analysis of variance)를 구한 후 Dancan's multiple test(P<0.05)를 이용하여 각 군의 평균간의 유의성을 검정하였다.
a-eMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-cMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-dMeans with the different letters are significantly different (P<0.05) by Duncan’s multiple range test.

성능/효과

1) Superoxide, hydroxyl radical(·OH), hydrogen peroxide(H2O2) singlet oxygen 등과 같은 ROS는2) superoxide distumase, catalase, glutathione reductase 등의 항산화 효소에 의해 제거되지만3)과도한 ROS 의 생성은 산화적 스트레스를 유발하고, 산화적 스트레스는 DNA변형 등을 일으켜 세포사멸을 유도하여 뇌질환, 심혈관계 질환, 당뇨, 암 및 노화의 원인이 된다.
4)특히 뇌는 불포화지방산과 순환하는 산소가 풍부하나 활성산소에 대한 항산화 효소가 상대적으로 다른 조직에 비해 작아 ROS에 의한 손상에 약하기 때문에 신경세포의 사멸로 인한 Alzheimer’s disease(AD)와 Parkinson disease같은 퇴행성 신경성 질환과 관련이 크다.
여주 활성물질인 protocatechuic acid를 농도별(5, 10, 50 µg/mL)로 처리하였을 때 control군에 비해 유의적으로 세포생존율이 증가하였으며, 특히 10 µg/ mL의 농도에서 80%이상의 높은 생존율을 보여 H2O2에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
그러나 protocatechuic acid를 농도별로 처리한 결과 모든 농도에서 control군 보다 유의적으로 높은 세포생존율을 보였으며, 특히 농도 10 µg/mL의 농도에서 65.73%의 가장 높은 세포생존율을 보였다(Fig. 3).
Aβ25-35를 처리하여 세포사멸을 유도한 control군은 normal군 100%에 비해 50.13%로 감소한 것을 확인할 수 있었다.
에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 신경 세포보호효과를 알아보기 위해 C6 glial cell을 이용하여 MTT assay를 시행하였다. 세포생존율 측정 결과, 정상군의 세포 생존율을 100%로 보았을 때 H₂O₂를 처리한 control군의 경우 65.50%로 감소하여 산화적 스트레스에 의한 손상을 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 여주 활성물질인 protocatechuic acid를 농도별(5, 10, 50 µg/mL)로 처리하였을 때 control군에 비해 유의적으로 세포생존율이 증가하였으며, 특히 10 µg/ mL의 농도에서 80%이상의 높은 생존율을 보여 H₂O₂에 의한 세포 손상에 대한 보호 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
2A). 실험 종료 시간 60분을 기준으로 control군의 ROS 생성량을 100%로 보았을 때 protocatechuic acid을 처리한 군은 control군에 비해 ROS 생성량이 감소한 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 2B). 따라서 protocatechuic acid는 H₂O₂에 의한 세포 산화에 대한세포 보호 효과와 활성산소종의 생성을 억제하거나 제거함으로써 신경세포에 사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것으로 생각된다.
본 연구에서는 C6 glial cell을 이용하여 여주(Momordica charantia)의 활성물질인 protocatechuic acid의 산화적 스트레스에 의한 신경세포 보호효과에 대해 알아보았다. 산화적 스트레스를 유발하기 위해 H₂O₂를 처리한 결과 protocatechuic acid는 모든 농도에서 유의적으로 세포생존율을 증가시켰으며, ROS생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 또한 AD의 원인물질로 알려져 있는 Aβ_25-35를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 유의적으로 세포생존율의 증가와 ROS 생성을 억제함을 확인 할 수 있었다.
산화적 스트레스를 유발하기 위해 H₂O₂를 처리한 결과 protocatechuic acid는 모든 농도에서 유의적으로 세포생존율을 증가시켰으며, ROS생성을 억제시키는 것을 알 수 있었다. 또한 AD의 원인물질로 알려져 있는 Aβ_25-35를 처리하여 산화적 스트레스를 유도하였을 때 유의적으로 세포생존율의 증가와 ROS 생성을 억제함을 확인 할 수 있었다. 이는 여주의 phenolic acid 구성물질인 protocatechuic acid가 신경세포 손상에 강력한 영향을 미치는 H₂O₂와 Aβ_25-35로부터의 산화적 스트레스를 개선함으로써 신경세포 손상에 대한 보호효과가 있음을 보여준다.
따라서 protocatechuic acid는 Aβ25-35에 의해 유도된 산화적 스트레스와 ROS에 대한 신경세포 보호 효과를 나타내어 신경세포 사멸에 영향을 미치는 인자들로부터 신경세포를 보호하는 작용이 있을 것으로 사료된다.
특히, protocatechuic acid 10 µg/mL 의 농도에서 normal군 수준으로 감소됨을 확인하였다(Fig. 4).
3). 또한 DCF-DA assay를 통한 ROS 생성억제 및 제거율을 측정한 결과 유의적으로 우수한 ROS 생성 억제율을 보였다. 특히, protocatechuic acid 10 µg/mL 의 농도에서 normal군 수준으로 감소됨을 확인하였다(Fig.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	H2O2란 무엇인가?	H2O2는 산소를 이용하는 생체의 대사 산물로 biological membrane를 자유롭게 통과하며 모든 세포의 조직에 apoptosis와 necrosis를 일으켜 세포 손상을 가져오는 산화제이다.26) 또한 H2O2는 구리나 철 이온 등과 Fenton반응에 의해 hydroxyl radical로 전환되어 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상, 지질과산화, 혈뇌장벽의 파괴 등을 일으키는 생체 독성 물질이다.
	H2O2가 in vitro에서 산화적 스트레스에 의한 신경퇴행성질환의 원인을 연구하기 위한 중요한 물질인 이유는 무엇인가?	H2O2는 산소를 이용하는 생체의 대사 산물로 biological membrane를 자유롭게 통과하며 모든 세포의 조직에 apoptosis와 necrosis를 일으켜 세포 손상을 가져오는 산화제이다.26) 또한 H2O2는 구리나 철 이온 등과 Fenton반응에 의해 hydroxyl radical로 전환되어 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상, 지질과산화, 혈뇌장벽의 파괴 등을 일으키는 생체 독성 물질이다.27,28) 특히, 이런 산화적 스트레스는 신경세포의 사멸을 일으켜 신경퇴행성 질환의 원인이 된다. 따라서 H2O2는 in vitro에서 산화적 스트레스에 의한 신경퇴행성질환의 원인을 연구하기 위한 중요한 물질이다.
	H2O2 어떤 과정을 통해 hydroxyl radical로 전환되는가?	H2O2는 산소를 이용하는 생체의 대사 산물로 biological membrane를 자유롭게 통과하며 모든 세포의 조직에 apoptosis와 necrosis를 일으켜 세포 손상을 가져오는 산화제이다.26) 또한 H2O2는 구리나 철 이온 등과 Fenton반응에 의해 hydroxyl radical로 전환되어 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상, 지질과산화, 혈뇌장벽의 파괴 등을 일으키는 생체 독성 물질이다.27,28) 특히, 이런 산화적 스트레스는 신경세포의 사멸을 일으켜 신경퇴행성 질환의 원인이 된다.

참고문헌 (35)

Valko, M. D., Leibfritz, J., Moncol, M. T., Cronin, M. M. and Telser, J. (2007) Free radical and antioxidants in normal physiological function and human disease. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 39: 44-84.

상세보기
Wiseman, H. and Halliwell, B. (1996) Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochem. J. 313: 17-20.

상세보기
Kim, T. S., Kang, S. J. and Park, W. C. (1999) Changes in antioxidants and antioxidants enzymes activities of soybean leaves subject to water stress. J. Korean Soc. Agric. Chem. Biol. 42: 246-251.
Stadtman, E. R. and Berlett, B. S. (1997) Reactive oxygenmediated protein oxidation in aging and disease. Chem. Res. Toxicol. 10: 485-494.

상세보기
Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzendacher, R. and Bossy- Wetzell, E. (2008) Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nat. Rev. Neurosci. 9: 505-518.

상세보기
Reynolds, A., Lauriea, C., Mosleya, L. R. and Gendelmana, E. H. (2007) Oxidative stress and the pathogenesis of neurodegenerative disorders. Int. Rev. Neurobiol. 82: 297-325.

상세보기
Choi, U., Shin, D.-W., Chang, Y.-S. and Shin, I.-J. (1992) Screening of natural antioxidant from plant and their antioxidative effect. Korean J. Food Sci. Technol. 24: 142-148.

원문보기 상세보기
Grover, J. K., Yadav, S. and Vats, V. (2002) Medicinal plants of India with anti-diabetic potential. J. Ethnopharmacl. 81: 81-100.

상세보기
Lee, H. J., Moon, J. H., Lee, W. M., Lee, S. G., Kim, A. K., Woo, Y.H. and Park, D. K. (2012) Charantin contents and fruit characteristics of bitter gourd (Momordica charantia L.) accessions. J. Bio-Environment Control 21: 379-384

원문보기 상세보기
Choi, J. S., Kim, H. Y., Seo, W. T., Lee, J. H. and Cho, K. M. (2012) Roasting enhances antioxidant effect of bitter melom (Momordica charantia L.) increasing in flavon-3-ol and phenolic acid contents. Food Sci. Biochnol. 21: 19-26.

원문보기 상세보기
Horax, R., Hettiarachchy, N. and Islam, S. (2005) Total phenolic contents and phenolic acid constituents in 4 varieties of bitter melon (Momordica charantia) and antioxidant activities of their extracts. J. Food Sci. 70: 275-280.
Ghaima, K. K., Nader, M. I., Tauqi, R. A. and Ghraibit, S. A. (2013) Extraction and identification of phenol compounds from bitter melon Momordica charantia fruits and their role as antioxidants. J. Biotechnology research center 7: 41-47.
Ali, L., Khan, A. K. A., Mamun, M. I. R., Mosihuzzaman, M., Nahar, N., Alam, M. N. and Rokeya, B. (1993) Studies on hypoglycemia effects of fruit pulp, seed and shole plant of Momordica charantia on normal and diabetic model rats. Planta Med. 59: 408-412.

상세보기
Srivastava, Y., Venkatadrishna-Bhatt, H., Verma, Y., Venkaiah, K. and Raval, B. H. (1993) Antidiabetic and adaptogenic properties of Momordica charantia extract: and experimental and clinical evaluation. Phytother. Res. 7: 785-789.
Cheng, L. Y. Tang, L., Yan, F., Wang, S. and Chen, F. (2004) The effects of the total saponin extract from the shoots of Momordica charantia L. on anti-virus HSV-II activity. J. Sichuan. Univ. (Nat. Sci. Ed.) 41: 641-643.
Hu, Q. S., Yang, Y. C. and Xia, H. (2004) Studies on inhibiting- bacteria of nature substance extracted from leaves and rattan of Momordica charantia Linn. Jiangxi. Huagong. 2: 70-74.
Zhang, R. Q., Ma, L. L., Lu, J. H., Hu, Y. Q. and Yu, J. F. (2003) A bacteriostatic test of leaf of Momordica charantia L. J. Gannan. Med. Coll. 23: 272-273.
Kubola, J. and Siriamorpun, S. (2008) Phenolic contents and antioxidant activities of bitter ground (Momordica charantia L.) leaf, stem and fruit fraction extracts in vitro. Food Chem. 110: 881-890.

상세보기
Divya, D., Hettiarachchy, N. S., Ganesh, V., Kanna, A. and Rayaprolu, S. (2013). Phenolic extracts from leaves of bitter melon (Momordica charantia) with antioxidant properties. JASA. 2: 28-34.
Alijadi, A. M. and Kamaruddin, M. Y. (2004) Evaluation or the phenolic contents and antioxidant capacity of two Malaysian floral honeys. Food Chem. 85: 513-518.

상세보기
Reyes, L. F. and Cisneros-zevallos, L. (2003) Wounding stress increases the phenolic content and antioxidant capacity of purple-flesh potatoes (Solanum tuberosum L.). J. Agric. Food Chem. 51: 5296-5300.

상세보기
An, L. J., Guan, S., Shi, G. F., Bao, Y. M., Duan, Y. L. and Jiang, B. (2006) Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against $MPP^{+}$ -induced neurotoxicity in PC12 cells. Food Chem. Toxicol. 44: 436-443.

상세보기
Ban, J. Y., Cho, S. O., Jeon, S-Y., Bae, K., Song, K-S. and Seong, Y. H. (2007) 3,4-dihydroxybenzoic acid from Smilacis chinae rhizome protects amyloid $\beta$ protein (25-35)- induced neurotoxicity in cultured rat cortical neurons. Neurosci. Lett. 420: 184-188.

상세보기
Mosman, T. (1983) Rapid colormetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Metb. 65: 55-63.

상세보기
Byun, Y. J., Kim, S. K., Kim, Y. M., Chae, G. T., Jeong, S. W. and Lee, S. B. (2009) Hydrogen peroxide induces autophagic cell death in C6 glioma cells via BNIP3-mediated suppression of the mTOR pathway. J. Neulet. 461: 131-135.
Diguiseppi, J. and Fridovich, I. (1984) The toxicity of molecular oxygen. CRC Crit. Rev. Toxicol. 12: 315-342.

상세보기
Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. C. (1991) Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch. Biochem. Biophys. 246: 501-504.
Crack, P. J. and Taylor, J. M. (2005) Reactive oxygen species and the modulation of stroke. Free Radic. Biol. Med. 38: 1433-1444.

상세보기
Kim, J. Y., Ju, H. S., Ban, J. Y., Song, K-S., Bae, K. H. and Seong, Y. H. (2009) Protective effect of Vitis amurensis stems and leaves extract on hydrogen peroxide-induced oxidative neuronal cell damage in cultured neurons. Korean J. Medicinal Crop Sci. 17: 68-74.

원문보기 상세보기
Kim, G., Lee, Y. K., Xu, H., Philbert, M. A. and Kopelman, R. (2010) Nano-encapsulation method for high selectivity sensing of hydrogen peroxide inside live cells. Anal. Chem. 82: 2165-2169.

상세보기
Butterfield, D. A., Drake, J., Pocernich, C. and Castegna, A. (2001) Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role of amyloid beta-peptide. Trends Mol. Med. 7: 548-554.

상세보기
Trubetskaya, V. V., Stepanichev, M. Y., Onufriev, M. V., Lazareva, N. A., Markevich, V. A. and Gulyaeva, N. V. (2003) Administration of aggregated beta-amyloid peptide (25-35) induces changes in long-term potentiation in the hippocampus in vivo. Neurosci. Behav. Physiol. 33: 95-98.
Yan, S. D., Fu, J., Soto, C., Chen, X., Zhu, H., Mohanna, F., Collison, K., Ahu, A., Stern, E., Saido, T., Tohyama, M., Ogawa, S., Roher, A. and Stern, D. (1997) An intracellular protein that binds amyloid-peptide and mediates neurotoxicity in Alzheimer's disease. Nature 75: 1039-1042.
Rike, C. J., Ramezan-Arab, N. and Cotman, C. W. (1997) Beta-amyloid neurotoxicity in vitro: evidence of oxidative stress but not protection by antioxidants. J. Neurochem. 69: 1601-1611.
Jang, J. H. and Surh, Y. J. (2002) $\beta$ -Amyloid induces oxidative DNA damage and cell death through activation of c- Jun N terminal kinase. Ann. N. Y. Acad. Sci. 973: 228-236.

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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