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문제 정의
- 현재 넙치에 수산용의약품으로 승인된 EM 에 대한 체내 잔류량에 대한 연구와 함께 투여시 어떤 영향이 있는지에 대한 선행연구가 필요하다. 그러므로 이번 연구에서는 넙치에 EM의 경구투여시 혈액에서 약물동력학적 기초 자료를 제시하고자 한다.
제안 방법
- 항생제를 함유한 배지는 최고 농도를 128 ㎍/㎖로 하여 12단계 농도로 2배씩 연속적으로 희석하여 만들었다. 106 cfu/㎖ 농도가 되도록 희석한 균을 항생제를 함유한 고체배지에 5 ㎕ 접종하여 18시간 배양 후, 항생제 농도에 따른 colony의 증식 양상을 관찰하였다.
- EM은 넙치 및 조피볼락의 세균성 질병 치료에 많이 쓰이고 있으며 (Treves-Brown, 2000), 어체내 MRL은 200 ng/㎖이며 휴약기간은 30일로 권고 하고 있다 (KFDA, 2006). EM을 50, 100, 200 ㎎/ ㎏으로 경구투여한 후 어체내 혈중 약물농도의 경시적 농도변화를 관찰하였다 [Fig. 2]. 투여후 50 mg/kg 투여시 최대 혈중농도 도달시간의 3시간이었으나 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 증가시 6시간으로 늘어남을 알 수 있었다.
- EM을 표준품 10 mg씩을 100 ㎖ 용량플라스크에 취하고 methanol에 녹여 100 ppm농도의 stock solution을 조제하였다. Working solution은 stock solution 10 ㎖을 정확히 취하여 100 ㎖ 용량플라스크에 옮기고 이동상으로 표시선까지 채운 표준 용액을 5, 10, 20, 100, 200 ng/㎖로 희석하여 사용하였다. 항생제 표준원액 (stock solution)은 4℃에 보관하였다.
- 분석기기는 LC/MS/MS (Agilent, 6410)를 이용하여 분석하였으며 분석조건은 [Table 1]에 나타내었다. 간단히 설명하면, 초기 이동상을 A mobile phase 및 B mobile phase 용매를 80:20의 비율로 흘리다가 10분 후 50:50으로 gradient 시킨 후 다시 초기 이동상으로 하여 20분간 분석하였다.
- 건강한 넙치 (평균체중 350±40g)를 실험수조에 옮겨 10일 동안 순치시킨 후, 실험구 당 36마리씩 수용하여 22℃로 설정한 사육수온에서 erythromycin thiocyanate (순도 76%; 대성미생물)의 약제첨가 사료를 각각 어체중 ㎏ 당 50, 100, 200 ㎎/kg이 되도록 강제로 1회 경구투여 및 50 ㎎/kg이 되도록 5일 동안 강제로 5회 투여하였다.
- 그리고 EM의 경시적 혈중농도는 WinNonlin program (Pharsight Co., Inc., USA)을 이용하여 약물동태학적 매개변수 조사를 하였다.
- 건강한 넙치 (평균체중 350±40g)를 실험수조에 옮겨 10일 동안 순치시킨 후, 실험구 당 36마리씩 수용하여 22℃로 설정한 사육수온에서 erythromycin thiocyanate (순도 76%; 대성미생물)의 약제첨가 사료를 각각 어체중 ㎏ 당 50, 100, 200 ㎎/kg이 되도록 강제로 1회 경구투여 및 50 ㎎/kg이 되도록 5일 동안 강제로 5회 투여하였다. 투여 후 1, 3, 6, 9, 24, 72, 120, 168, 264, 360, 504, 720시간까지 5마리씩 마취 후 0.8~1.0 ㎖ 씩 채혈하여 혈청 분리후 (200 ㎕) -80 ℃에 보관하였다가 분석에 사용하였다.
- 실험균은 Kim et al, (2013)의 방법을 기초로 Mueller Hinton 배지에서 37℃의 온도조건에서 하룻밤 동안 전 배양하였으며, 항생제의 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)의 측정은 고체배지 희석법에 의하여 실시하였다. 항생제를 함유한 배지는 최고 농도를 128 ㎍/㎖로 하여 12단계 농도로 2배씩 연속적으로 희석하여 만들었다. 106 cfu/㎖ 농도가 되도록 희석한 균을 항생제를 함유한 고체배지에 5 ㎕ 접종하여 18시간 배양 후, 항생제 농도에 따른 colony의 증식 양상을 관찰하였다.
- 항생제 표준원액 (stock solution)은 4℃에 보관하였다. 회수율은 EM의 표준용액을 10, 50, 100 ng/㎖의 농도로 넙치의 혈청에 첨가한 후, EM을 추출하여 LC/MS/MS로 분석하였다.
대상 데이터
- 넙치 및 다른 어종에서 분리된 그람 양성 및 음성균 6종 Streptococcus iniae, Staphylococcus epidermidis, Edwardsiella tarda, Vibrio harveyi, Vibrio anguillarum, Photobacterium damselae subsp. damselae을 항균활성 실험에 사용하였다.
- 이 연구에서 사용된 표준품 Erythromycin은 Sigma사 (USA)를 사용하였고, 실험어에 투여된 약품은 erythromycin thiocyanate (순도 76%; 대성 미생물)를 사용하였다. 기기분석을 위한 HPLC용 acetonitrile, methanol 및 증류수 등 용매류는 Merck사 (Germany)를 사용하였으며, 기타 이 실험에 사용된 모든 시약은 특급 이상을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 어류는 국립수산과학원 연수소 내 항생제 투여를 받은 적이 없는 건강한 넙치(평균체중 350±40g)를 36마리 사용하였고 사육 수온은 22±1℃로 일정하게 유지하였다.
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4. LC/MS/MS 분석조건
분석기기는 LC/MS/MS (Agilent, 6410)를 이용하여 분석하였으며 분석조건은 [Table 1]에 나타내었다. 간단히 설명하면, 초기 이동상을 A mobile phase 및 B mobile phase 용매를 80:20의 비율로 흘리다가 10분 후 50:50으로 gradient 시킨 후 다시 초기 이동상으로 하여 20분간 분석하였다.
- 이 연구에서 사용된 표준품 Erythromycin은 Sigma사 (USA)를 사용하였고, 실험어에 투여된 약품은 erythromycin thiocyanate (순도 76%; 대성 미생물)를 사용하였다. 기기분석을 위한 HPLC용 acetonitrile, methanol 및 증류수 등 용매류는 Merck사 (Germany)를 사용하였으며, 기타 이 실험에 사용된 모든 시약은 특급 이상을 사용하였다.
이론/모형
- 샘플은 Salvo et al. (2013a)의 방법을 기초로, 혈장 200 ㎕에 동량의 acetonitrile을 가하여 혼합한 후 10분간 방치, 10,000 rpm, 20분간 원심분리 후 그 상등액을 취하여 여과한 다음에 LC/MS/MS로 분석하였다.
- 실험균은 Kim et al, (2013)의 방법을 기초로 Mueller Hinton 배지에서 37℃의 온도조건에서 하룻밤 동안 전 배양하였으며, 항생제의 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC)의 측정은 고체배지 희석법에 의하여 실시하였다. 항생제를 함유한 배지는 최고 농도를 128 ㎍/㎖로 하여 12단계 농도로 2배씩 연속적으로 희석하여 만들었다.
성능/효과
- 01 ㎍/㎖로 농도간 증가는 있으나 100mg/kg 투여시와 200 mg/kg 투여시에는 농도 증가 시 최고혈중농도 도달시간과 혈중농도의 증가가 있으나 유의적이지 못하였다. 50 mg/kg을 5일동안 투여시 Tmax가 약간 증가하나 Cmax는 감소함을 알 수 있었다.
- 05 ppm이하로 배출되는데 대략 20일 가량이 소요됨을 알 수 있었다. 50mg/kg을 5일 동안 투여시 약물의 체내 대사 기간이 27일 이상 소요됨을 알 수 있었다. EM은 약물 농도 의존적으로 혈액에서 검출되며, 50mg/kg 1회 경구투여와 50 mg/kg 5회 투여방법에 따른 약물 검출 차이 및 어종의 적정수온에 따라서 EM의 배출속도가 다를것이라 생각되며, 무지개 송어와 (Salvo et al.
- EM의 표준은 검량선의 작성은 표준용액을 acetonitrile로 5, 10, 20, 100, 200 ppb로 희석하여 분석한 결과 농도에 따라 직선성 (r2 값)은 0.9997을 나타내어 아주 양호한 검량선이 구해졌다 [Fig. 1]. 이 실험의 EM의 검출한계 (LOD, Limit of Detection)와 정량한계 (LOQ, Limit of Quantitation)은 2.
- Gram positive bacteria인 S. iniae가 가장 sensitive 했고, gram negative bacteria들은 낮은 민감도인 16∼64 ㎍/㎖로 나타났다.
- , 2013b), 방어 (Katae,1980)와 넙치의 약물대사작용을 비교해보면, 넙치의 혈중 배출속도가 느린 것은 어종의 높은 사육 수온과 낮은 활동성으로 인해 체내물질대사 속도가 느린 것으로 사료된다. 경구투여에 의한 실험 결과 수치는 어체내 대사작용에 있어 조직으로 분포되는 분포상과 간이나 신장을 통하여 소실되는 분포후상의 two-compartment 모델로 나타났다[Table 3].
- 넙치 EM 경구투여 그룹 (50, 100, 200 ㎎/㎏)에 대해 EM 투여 후 시료로부터 혈청을 분리하여 2-compartment model을 통한 LC/MS/MS로 분석한 결과, 혈장농도-시간곡선하면적 (AUC)은 50 mg/kg 투여시 165.3 hr*㎍/㎖, 100 mg/kg 투여시 212. 83 hr*㎍/㎖, 200 mg/kg 투여시 592.
- , 2013a), 혈류에서는 EM의 축적이 일어나지 않았다. 반면, 넙치에서는 약물이 혈중에서 0.2 ppm이하로 배출되는데 50 mg/kg 1회 경구투여는 3일이 소요되었고, 100 및 200 mg/kg 1회 경구투여는 5일이었으며, 50 mg/kg 5일 동안 경구투여는 11일 가량이 소요되었고, 0.05 ppm이하로 배출되는데 대략 20일 가량이 소요됨을 알 수 있었다. 50mg/kg을 5일 동안 투여시 약물의 체내 대사 기간이 27일 이상 소요됨을 알 수 있었다.
- 최고혈중농도 도달시간 (Tmax) 및 최고혈중농도 (Cmax)도 50 mg/kg 투여시 Tmax 는 1.55 h, Cmax는 34.63 ㎍/㎖, 100 mg/kg 투여시 Tmax 3.99 h, Cmax 60.38 ㎍/㎖, 200 mg/kg 투여시 Tmax는 4 h, Cmax는 63.01 ㎍/㎖로 농도간 증가는 있으나 100mg/kg 투여시와 200 mg/kg 투여시에는 농도 증가 시 최고혈중농도 도달시간과 혈중농도의 증가가 있으나 유의적이지 못하였다. 50 mg/kg을 5일동안 투여시 Tmax가 약간 증가하나 Cmax는 감소함을 알 수 있었다.
- 2]. 투여후 50 mg/kg 투여시 최대 혈중농도 도달시간의 3시간이었으나 100 mg/kg 및 200 mg/kg으로 증가시 6시간으로 늘어남을 알 수 있었다. 다른 어종인 무지개 송어에 75 mg/kg을 매일 10일 동안 투여한 실험에서도 혈중 약물의 농도가 6시간 째에 가장 높게 나타났고, 24시간째에 급격한 감소를 하였다.
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