[논문]쥐의 큰포식세포주에서 자가포식현상에 의한 Salmonella enterica serovar Typhimurium의 감염 조절

이선혜; 김주영; 이효지; 정유진

doi:10.7845/kjm.2014.4008

쥐의 큰포식세포주에서 자가포식현상에 의한 Salmonella enterica serovar Typhimurium의 감염 조절
Induced Autophagy Regulates Salmonella enterica serovar Typhimurium Infection in Murine Macrophage 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.50 no.1, 2014년, pp.27 - 32

이선혜 (강원대학교 의료.바이오신소재융복합연구사업단) , 김주영 (강원대학교 자연과학대학 생명과학과) , 이효지 (강원대학교 자연과학대학 생명과학과) , 정유진 (강원대학교 의료.바이오신소재융복합연구사업단)

초록
AI-Helper

자가포식현상(autophagy)은 세포 내 또는 세포 외의 스트레스나 영양분의 고갈, 그리고 병원체 감염에 의해 유도되는 기전으로, 병원균, 손상된 단백질이나 세포 소기관을 autophagosome으로 격리하여 리소좀(lysosome)과 융합하여 분해시키는 기전이다. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)은 세포 내로 감염되는 세균으로 급성 위장염과 식중독을 야기한다. S. Typhimurium 감염 시 세포 내에서 자가포식현상이 유도되며 이는 감염을 제어하는데 중요하다는 연구 논문들을 통해 본 연구에서는 자가포식현상 유도제인 rapamycin으로 자가포식현상을 유도했을 때, S. Typhimurium의 감염을 조절할 수 있는지 알아보고자 하였다. 자가포식현상 유도제인 rapamycin과 저해제인 3-methyladenine(3-MA)를 각각 처리한 후 쥐의 큰포식세포주인 RAW 264.7 세포에 S. Typhimurium을 감염시켰다. rapamycin을 전처리한 후 S. Typhimurium을 감염시켰을 때, 세포 내에서 S. Typhimurium의 성장률이 감소한 반면 3-MA의 전처리는 S. Typhimurium의 성장을 촉진시켰다. 또한, RAW 264.7 세포에 rapamycin을 처리 후 감염시켰을 때, 자가포식현상 관련 단백질의 발현이 유의하게 증가하였다. Rapamycin에 의하여 유도된 자가포식현상이 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성 산화질소종(nitric oxide, NO)의 생성을 통해 감염을 제어하는지를 확인하기 위하여 이 두 물질을 측정하였다. 감염 전 rapamycin 처리 시 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성은 증가하였으나 ROS의 생성에는 별다른 차이가 없었다. 이상의 결과는 쥐의 큰포식세포주에서 rapamycin처리로 유도된 자가포식현상은 NO 생성을 통해 항박테리아능을 나타낸다고 할 수 있다.

Abstract ▼ AI-Helper

Autophagy is one of the lysosomal degradation pathways to maintain cellular homeostasis. The damaged proteins or organelles are uptaken through extra- and intra-cellular stress, starvation and infected pathogens, subsequently, autophagosomes are fused with lysosomes to break down the molecules. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), intracellular bacteria, cause acute gastroenteritis and food poisoning. Given that autophagy induced by S. Typhimurium plays an important role in the cells to control the infection, we identify whether the induction of autophagy with rapamycin, chemical inducer of autophagy, before infection regulates S. Typhimurium infection. After treatment of rapamycin or 3-methyladenine (3-MA), autophagy inhibitor, RAW264.7 cells were infected with S. Typhimurium. Pretretment of rapamycin decreased the growth rate of S. Typhimurium in the cells; otherwise, pretreatment of 3-MA increased the growth rate of S. Typhimurium. The expression of autophagy-related genes was significantly increased in the S. Typhimurium-infected cells pretreated with rapamycin. To examine whether induced autophagy by rapamycin control the infection with increase the production of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO), antibacterial radical substrates were measured in infected cells followed by the treatment with either rapamycin or 3-MA. NO production increased in RAW264.7 cells; otherwise, ROS production remained unchanged during the infection. These findings suggest that inducing autophagy with rapamycin reveals antimicrobial activity as producing NO against S. Typhimurium infection in mouse macrophages.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

7 세포에 rapamycin을 처리 후 감염시켰을 때, 자가포식현상 관련 단백질의 발현이 유의하게 증가하였다. Rapamycin에 의하여 유도된 자가포식현상이 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성 산화질소종 (nitric oxide, NO)의 생성을 통해 감염을 제어하는지를 확인하기 위하여 이 두 물질을 측정하였다. 감염 전 rapamycin 처리 시 RAW 264.
Typhimurium)은 세포 내로 감염되는 세균으로 급성 위장염과 식중독을 야기한다. S. Typhimurium 감염 시 세포 내에서 자가포식현상이 유도되며 이는 감염을 제어하는데 중요하다는 연구 논문들을 통해본 연구에서는 자가포식현상 유도제인 rapamycin으로 자가포식 현상을 유도했을 때, S. Typhimurium의 감염을 조절할 수 있는지 알아보고자 하였다.
Typhimurium 감염 시 MAPK 신호전달 과정을 통해 활성산소종(ROS)과 산화질소(NO)를 유도한다고 보고된 바 있다(Rosenberger and Finlay, 2002). 따라서 자가포식현상 조절물질 처리 시 S. Typhimurium에 감염된 RAW 264.7 세포에서 ROS와 NO의 변화를 측정하고자 하였다. RAW 264.
최근에 발표된 연구에 따르면 병원균의 성장을 제어하는 숙주의 방어기작 중 병원균 감염 시 유도되는 자가포식현상이 병원균 감염에 중요한 역할을 수행한다고 한다(Monastyrska and Klionsky, 2006). 따라서, 본 실험에서는 쥐의 큰포식세포주인 RAW 264.7 세포에서 자가포식현상 조절 시 S. Typhimurium 감염을 제어할 수 있는지 알아보고자 하였다.
하지만, 그 기전은 명확하지 않은 채로 남아있다. 따라서, 본 연구에서는 자가포식현상이 쥐의 큰포식세포 내에 감염된 S. Typhimurium을 제어할 수 있는지 알아보고자 하였다.

제안 방법

2일 동안 안정화한 후 자가포식현상 저해제인 3-MA와 자가포식현상 유도제인 rapamycin을 처리하였다. 0, 4, 8, 24시간에 세포를 수확하여 세포 수를 세어 진행하였다. 각각의 시간에 수확한 세포를 tryphan blue (Sigma-Aldrich)로 염색한 후, 혈구계(hemacytometer) 상에서 염색된 세포 수를 세었다.
cell/ml로 분주하였다. 2일 동안 안정화한 후 자가포식현상 저해제인 3-MA와 자가포식현상 유도제인 rapamycin을 처리하였다. 0, 4, 8, 24시간에 세포를 수확하여 세포 수를 세어 진행하였다.
Typhimurium을 각 배양 조건 별로 준비하여 MOI (multiplicity of infection)가 10:1이 되도록 감염시켰다. 30분 동안 감염시킨 후 상층액 내의 균을 PBS로 2번 세척하여 제거하였고 gentamicin (Gibco BRL Life Technologies)을 배지에 첨가하여 세포에 24시간 동안 처리하였다. 세포 내 S.
2% triton X-100이 함유된 PBS로 세포의 투과성을 높였다. Anti-LC3-human (MBL, Japan)를 포함하는 1차 항체로 두 시간 동안 실온에서 염색하였고, PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 세척 후 FITC-anti-rabbit 2차 항체(Jackson Immunoresearch, USA)를 한 시간 동안 실온에서 염색한 다음 PBS로 5분씩 3회 세척하였다.
RAW 264.7 세포에 자가포식현상 조절 물질인 3-MA와 rapamycin을 처리한 후 S. Typhimurium으로 감염시켰다. 감염 후 10분에 DCFH-DA (dichlorofluorescin diacetate) 1 µl/ml을 20분 동안 처리하고 PBS로 세척한 후 수확하였다.
RAW 264.7 세포에서 S. Typhimurium 감염 시 자가포식현상 조절에 따른 숙주 세포 성장률의 변화를 확인하기 위하여, RAW 264.7 세포에 자가포식현상 유도제인 rapamycin (1 µM)을 2시간 전 처리한 후, S. Typhimurium을 10 MOI로 30분 동안 감염 뒤 시간에 따른 세포 성장률을 측정하였다.
부착되지 않은 세포는 PBS (phosphate buffered saline; Gibco BRL Life Technologies, USA)를 이용하여 세척한 후 제거하였고 부착된 세포만 취하여 실험에 사용하였다. S. Typhimurium을 각 배양 조건 별로 준비하여 MOI (multiplicity of infection)가 10:1이 되도록 감염시켰다. 30분 동안 감염시킨 후 상층액 내의 균을 PBS로 2번 세척하여 제거하였고 gentamicin (Gibco BRL Life Technologies)을 배지에 첨가하여 세포에 24시간 동안 처리하였다.
S. Typhimurium의 성장 저해가 자가포식현상에 의한 것인지 알아보기 위하여, 자가포식현상 관련 단백질인 Atg16L1, beclin-1, Atg12-5 complex, LC3의 발현을 western blot을 통해 관찰하였다. 자가포식현상과 관련된 단백질의 발현은 S.
0, 4, 8, 24시간에 세포를 수확하여 세포 수를 세어 진행하였다. 각각의 시간에 수확한 세포를 tryphan blue (Sigma-Aldrich)로 염색한 후, 혈구계(hemacytometer) 상에서 염색된 세포 수를 세었다. 대조구는 자극물질이 포함되지 않은 배양액을 처리한 군이다.
Typhimurium의 생존율을 비교하기 위하여, PBS로 세척한 후 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 10분 동안 처리하여 세포막을 파괴하였다. 그 후 세포 내 생존균 수를 알아보기 위해 LB agar 배지에 접종하여 20시간에 균의 집락을 측정하였다.
단백질 분리를 위해 SDS-PAGE를 수행하였으며, 30% Acrylamide, 1 M Tris HCl (pH 8,8, pH 6.8), 10% SDS, 10% Ammonium persulfate, TEMED, 증류수, 6× SDS gel loading buffer, 1× SDS running buffer가 사용되었다.
마지막으로 핵을 염색하기 위해 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma-Aldrich)를 이용하여 5분 동안 염색한 후 PBS로 5회 세척하여 분광형 공초점 레이저 현미경(Olympus, FV1000 SPD)을 통해 세포를 관찰하였다.
, Agar powder; DAEJUNG, Korea) 배지에 접종하여 37℃ 배양기에서 배양 한 후 사용하였다. 배양한 S. Typhimurium은 다시 LB 액체배지에서 진탕 배양하여 흡광도 값을 측정하였다. OD₆₀₀=0.
본 논문에서는 Western blot에 나타나는 밴드들의 밀도를 측정하여 밴드들 사이의 정량적인 비교를 하기 위해 Image J Program (National Institutes of Health)을 이용하여 β-actin과 LC3-ll의 필름상의 밀도를 측정하였고 이들의 비율을 계산하였다.
산화질소는 공기 중에서 수 초 내에 아질산염 이온(nitrite ion)으로 산화되기 때문에, 산화질소의 생산을 아질산염 이온의 농도로 측정하였다. 아질산염 이온의 측정은 Intron-bio사의 nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology Inc.
30분 동안 감염시킨 후 상층액 내의 균을 PBS로 2번 세척하여 제거하였고 gentamicin (Gibco BRL Life Technologies)을 배지에 첨가하여 세포에 24시간 동안 처리하였다. 세포 내 S. Typhimurium의 생존율을 비교하기 위하여, PBS로 세척한 후 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich)을 10분 동안 처리하여 세포막을 파괴하였다. 그 후 세포 내 생존균 수를 알아보기 위해 LB agar 배지에 접종하여 20시간에 균의 집락을 측정하였다.
원심분리 후, 상층액을 제거한 뒤 PBS를 첨가하여 세포를 부유시켰다. 세포는 유세포 분석기(FACS Calibur, Biosciences)를 통해 형광 정도에 따른 세포를 분석하여 전체적인 세포 내 활성산소 수준을 측정하기 위하여 사용되었다.
자가포식현상 유도제인 rapamycin과 저해제인 3-methyladenine (3-MA)를 각각 처리한 후 쥐의 큰포식세포주인 RAW 264.7 세포에 S. Typhimurium을 감염시켰다. rapamycin을 전처리한 후 S.
7 세포를 18 mm 직경의 둥근 Coverslip (SPL lifesciences, Korea)을 넣은 12-well 세포 배양접시에 5 × 10⁴ cell/ml로 분주 한 후, 2일 동안 안정화하였다. 자가포식현상의 조절 물질인 3-MA와 rapamycin을 처리하였고, S. Typhimurium을 감염시킨 후 4% Para-formaldehyde/PBS로 15분간 실온에서 고정하였다. 그 후, 15분간 0.

대상 데이터

또한 antiLC3B, anti-Atg12, anti-Atg16L1, anti-Beclin-1은 Cell signaling Technologies (USA)에서, 그리고 anti-β-actin은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (USA)에서 구매하였다.
본 실험에 사용된 S. Typhimurium은 LB agar (Tryptone; BD Biosiences, USA, Yeast extract powder, USA, Sodium Cloride; Bio Basic Inc., Agar powder; DAEJUNG, Korea) 배지에 접종하여 37℃ 배양기에서 배양 한 후 사용하였다. 배양한 S.
본 실험에서 사용된 세포 주는 쥐의 대식세포인 RAW 264.7를 사용했다. 이 세포는 RPMI 1640에 10% heat inactivated fetal bovine serum (FBS, USA), 1% PS (Penicillin-Streptomycin, Gibco-BRL, USA)을 혼합한 후, 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하였다.
자가포식현상 억제제인 3-MA와 자가포식현상 유도제인 rapamycin은 Sigma-Aldrich (USA)에서 구매하였다. 또한 antiLC3B, anti-Atg12, anti-Atg16L1, anti-Beclin-1은 Cell signaling Technologies (USA)에서, 그리고 anti-β-actin은 Santa Cruz Biotechnology, Inc.
쥐의 큰포식세포주인 RAW 264.7 cell을 1×104 cells/ml 농도로 부유시켜 37℃, 5% CO2 조건에서 2일 동안 24-well 세포배양 접시(SPL #30006; SPL lifesciences, Korea)에 배양하였다.

데이터처리

각각의 독립된 실험에서 얻어진 데이터에서 통계적 유의성은 GraphPad Prism 5 (GraphPad software)을 사용한 unpaired Student’s t-test에 의해 측정되었다(*, P<0.05, **, P<0.01, ***, P<0.001, and n.s., not significant).

이론/모형

산화질소는 공기 중에서 수 초 내에 아질산염 이온(nitrite ion)으로 산화되기 때문에, 산화질소의 생산을 아질산염 이온의 농도로 측정하였다. 아질산염 이온의 측정은 Intron-bio사의 nitric oxide detection kit (Intron Biotechnology Inc., Korea)을 사용하였다. RAW 264.

성능/효과

Densitometry로 각 밴드의 밀도를 측정해본 결과, rapamycin 전 처리 후 S. Typhimurium으로 감염시켰을 경우 β-actin 대비 LC3-II의 비율이 증가함을 입증하였다(Fig. 2B).
Typhimurium은 다시 LB 액체배지에서 진탕 배양하여 흡광도 값을 측정하였다. OD₆₀₀=0.9Å에 들어 있는 균의 수를 정확히 계산하기 위하여, LB 액체배지에 존재하는 균을 희석하여 LB agar 배지에 접종한 후 20시간 후에 colony의 수를 세어 CFU (colony-forming unit)를 확인하였고 흡광도 값이 OD₆₀₀=0.9Å일 때 10⁹ CFU/ml 균을 포함한다.
7 세포에서 ROS와 NO의 변화를 측정하고자 하였다. RAW 264.7 세포에 S. Typhimurium을 감염 시킨 후 30분에 ROS와 반응하여 형광을 나타내는 DCFH-DA를 처리 한 뒤 세포 내의 ROS 수준을 유세포 분석기(FACS)로 간접적으로 측정한 결과, 자가포식현상 조절물질의 처리에 따른 ROS의 생성은 각 그룹 사이에 별다른 차이가 없었다(Fig. 3A). 유세포 분석기를 통해 얻은 결과를 평균형광감도(mean fluorescence intensity, MFI)로 수치화한 결과 역시 자가포식현상 조절물질의 처리 유무에 따른 ROS 생산 차이는 관찰할 수 없었다(Fig.
7 세포에 감염된 박테리아의 성장은 자가포식현상 유도제인 rapamycin이나 자가포식현상 저해제인 3-MA 처리에 따라 다르게 관찰되었다. Rapamycin을 전처리한 세포에서는 S. Typhimurium을 감염시켰을 때 박테리아의 성장이 2배 이상 저해되었으나, 3-MA (10 mM)를 전처리한 세포에서는 S. Typhimurium의 성장이 아무것도 처리하지 않은 그룹에 비해 1.5배 증가하였다(Fig. 1B). 또한 3-MA와 rapamycin을 함께 처리하였을 때 박테리아 성장은 감염만 시킨 그룹과 차이가 없었다(Fig.
, 2009), poly (I:C)의 처리 그룹은 양성 대조군으로 사용하였다. S. Typhimurium 감염 후 poly (I:C)를 처리하였을 때에도 LC3-I에서 LC3-II로 전환된 비율이 높게 관찰되었으며, Atg12-5 complex의 발현 역시 증가하였다. 그에 반해 3-MA의 처리는 rapamycin에 의해 증가된 LC3-II의 발현뿐만 아니라, Atg12-5 complex의 발현을 감소시켰다(Fig.
Typhimurium을 10 MOI로 30분 동안 감염 뒤 시간에 따른 세포 성장률을 측정하였다. 각 시간에 세포수를 측정한 결과, 감염 후 24시간에 감염만 시킨 그룹과 rapamycin을 전 처리 한 그룹에서 세포 성장률이 감소하는 듯 보였으나 각 그룹 사이에서의 유의성은 없었다(Fig. 1A). 따라서 rapamycin 처리 및 S.
3B). 그에 반해, RAW 264.7 세포에 S. Typhimurium으로 감염만 시킨 그룹에 비해 rapamycin을 전 처리 한 후 S. Typhimurium을 감염시킨 그룹에서 NO의 생성이 2.1배 증가함을 관찰하였다(Fig. 3C).
따라서 이상의 결과를 통해 쥐의 큰포식세포에서 자가포식현상의 조절은 NO의 생산을 유도함으로써 S. Typhimurium 성장을 저해시킨다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 자가포식현상 유도제가 차후 감염성 병원균의 치료제로 개발될 가능성이 있음을 시사한다.
Typhimurium의 성장을 촉진시켰다. 또한, RAW 264.7 세포에 rapamycin을 처리 후 감염시켰을 때, 자가포식현상 관련 단백질의 발현이 유의하게 증가하였다. Rapamycin에 의하여 유도된 자가포식현상이 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 활성 산화질소종 (nitric oxide, NO)의 생성을 통해 감염을 제어하는지를 확인하기 위하여 이 두 물질을 측정하였다.
2B). 면역형광염색법으로 세포 내 LC3의 발현을 확인해본 결과, RAW 264.7 세포에 rapamycin을 전 처리한 후 S. Typhimurium을 감염시켰을 때, LC3의 세포 내 발현이 감염만 시킨 그룹에 비해 현저히 증가하였다(Fig. 2C). 분광형 공초점 레이저 현미경으로 관찰한 결과를 DAPI로 염색된 세포 중에 LC3를 발현하는 세포의 비율로 나타내었을 때, 감염만 시킨 그룹에 비해 rapamycin을 전 처리한 후 S.
2C). 분광형 공초점 레이저 현미경으로 관찰한 결과를 DAPI로 염색된 세포 중에 LC3를 발현하는 세포의 비율로 나타내었을 때, 감염만 시킨 그룹에 비해 rapamycin을 전 처리한 후 S. Typhimurium을 감염 시킨 그룹에서 LC3를 발현하는 세포의 비율이 2.3배 증가하였다(Fig. 2D).
3A). 유세포 분석기를 통해 얻은 결과를 평균형광감도(mean fluorescence intensity, MFI)로 수치화한 결과 역시 자가포식현상 조절물질의 처리 유무에 따른 ROS 생산 차이는 관찰할 수 없었다(Fig. 3B). 그에 반해, RAW 264.
Typhimurium의 성장이 2배 이상 저해되었다. 이러한 S. Typhimurium 성장 제어가 자가포식현상에 의한 것인지 확인해본 결과, rapamycin을 전 처리 후 S. Typhimurium 감염 시켰을 경우 자가포식현상 표지자인 LC3-II의 전환이 증가함과 함께 LC3를 발현하는 세포 또한 증가한 것을 관찰하였다. 이를 통해 rapamycin전 처리에 의한 S.
Typhimurium 감염 시켰을 경우 자가포식현상 표지자인 LC3-II의 전환이 증가함과 함께 LC3를 발현하는 세포 또한 증가한 것을 관찰하였다. 이를 통해 rapamycin전 처리에 의한 S. Typhimurium 성장 저해는 자가포식현상에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 이 뿐만 아니라, rapamycin을 전 처리하고 S.
7 세포에서 NO의 생성은 증가하였으나 ROS의 생성에는 별다른 차이가 없었다. 이상의 결과는 쥐의 큰포식세포주에서 rapamycin처리로 유도된 자가포식현상은 NO 생성을 통해 항박테리아능을 나타낸다고 할 수 있다.
1배 증가하였다. 이상의 결과를 통해, rapamycin에 의해 유도된 자가포식현상은 ROS의 유도를 통해서 라기보다는 NO에 의한 것임을 입증하였다.
Typhimurium의 성장 저해가 자가포식현상에 의한 것인지 알아보기 위하여, 자가포식현상 관련 단백질인 Atg16L1, beclin-1, Atg12-5 complex, LC3의 발현을 western blot을 통해 관찰하였다. 자가포식현상과 관련된 단백질의 발현은 S. Typhimurium 감염에 의해 전반적으로 증가되었고, 특히 rapamycin 처리 시 자가포식현상의 표지자로 중요하게 여겨지는 LC3가 LC3-I에서 LC3-II로 전환된 비율이 높게 관찰되었으며, Atg12-5 complex의 발현 역시 증가하였다(Fig. 2A). 최근 톨-유사 수용체 3(toll-like receptor 3, TLR3)에 대한 리간드(ligand)인 poly (I:C)를 S.

후속연구

Typhimurium 성장을 저해시킨다는 것을 입증하였다. 이러한 결과는 자가포식현상 유도제가 차후 감염성 병원균의 치료제로 개발될 가능성이 있음을 시사한다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Salmonella enterica serovar Typhimurium은 어떤 균입니까?	Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)는 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 그람 음성 간균으로 편모를 가지고 있으며, 세포 내 기생세균이다(de Jong et al., 2012).
	자가포식현상은 어떤 상황에서 발생합니까?	자가포식현상(autophagy)은 세포 내 또는 세포 외의 스트레스나 영양분의 고갈, 그리고 병원체 감염에 의해 유도되는 기전으로, 병원균, 손상된 단백질이나 세포 소기관을 autophagosome으로 격리하여 리소좀(lysosome)과 융합하여 분해시키는 기전이다. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S.
	Salmonella enterica serovar Typhimurium이 숙주 세포의 면역반응을 피하기 위해 형성하는 막 구조물은 무엇입니까?	S. Typhimurium은 숙주세포 내에 침입하고 증식하기 위해 특이적인 구획을 형성하여 숙주세포의 면역반응을 피할 수 있는데, 이 특이적인 막 구조물을 Salmonella-containing vacuole (SCV)라 부른다(Lindgren et al., 1996).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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