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문제 정의
- 본 실험에서는 담배식물과 그 재배 토양 및 담배의 잎, 줄기, 뿌리에서 니코틴을 분해하는 세균을 분리하였고, 그 중 한 균주가 Arthrobacter 속의 새로운 균주일 가능성이 있는 NU11을 대상으로 그 특성을 조사하였다.
제안 방법
- Catalase와 oxidase 시험은 MB/N 배지에서 30℃에서 3일간 배양한 NU11 균주를 이용하여 콜로니 위에 3% (v/v) H2O2를 떨어뜨린 후 기포발생 유무 관찰을 통해 catalase 시험을 수행하였고, oxidase 시험은 콜로니 위에 oxidase reagent를 떨어뜨려 콜로니의 색이 보라색으로 변화하는지를 확인하여 조사하였다.
- PCR 반응은 1X 반응용액 (20 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20, 0.5% Nonidet P-40, 50% Glycerol)에 2.5 mM dNTP, 각 primer 2 µl, 상기 콜로니 현탁용액(template DNA) 1 µl, Taq polymerase 1 unit을 첨가하여 최종 부피를 20 µl로 하여 반응하였다.
- 균의 성장에 따른 니코틴 분해 조사는 Meng 등(2010)을 변형 하여 다음과 같이 조사하였다. MB/N 고체배지에서 30℃에서 3일 동안 배양한 NU11을 5 ml의 MB/N 액체배지에 접종하여 30℃에서 4일간 종배양하였다.
- 균주의 산 생산 유무, 탄소원 확인 및 여러 효소 생산의 확인을 위해 API 20NE, API 32GN을 사용하였다. 실험 방법과 결과 해석은 API kit 제조사에서 제공하는 사용 설명서를 따라 실행하였으며, 결과판독은 30℃에서 24시간과 48시간 때의 관찰을 바탕으로 이루어졌다.
- 니코틴 분해 박테리아 분리를 위해 사용한 MB/N 배지는 최소 배지에 미량원소와 니코틴을 각각 0.1%씩 첨가하여 만들었다. 최소배지는 1 L의 증류수에 0.
- 담배식물과 담배재배 토양으로부터 최소배지에 유일 탄소원으로 니코틴을 첨가한 배지(MB/N)를 이용하여 니코틴을 분해하는 새로운 균주의 분리를 시도하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석과 표현형 시험 및 형태학적 시험으로 분리균주들은 Micrococcaceae 과의 Arthrobacter 속에 포함되는 균주로 판명되었다.
- 5 mM dNTP, 각 primer 2 µl, 상기 콜로니 현탁용액(template DNA) 1 µl, Taq polymerase 1 unit을 첨가하여 최종 부피를 20 µl로 하여 반응하였다. 반응조건은 95℃에서 2분간 predenaturation을 거친 후 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30회 반복 후 72℃에서 5분 동안 마지막 신장과정을 수행하였다. 증폭된 산물은 PCR purification kit (Real Biotech corp.
- 본 실험을 통해 분리된 NU11 및 NU15 균주의 분류학적 위치를 알아보기 위해 NU11 및 NU15 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 이용하여 이 속(genus)에 속하는 type strain들과 근연 관계에 있는 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻어 계통수를 작성하였다(Fig. 2). 그 결과 NU11 및 NU15 균주는 Arthrobacter nitroguaiacolicus (AJ512504), Arthrobacter histidinolovorans (X83406), Arthrobacter aurescens (X83405), Arthrobacter ureafaciens (X80744), Arthrobacter ilicis (X83407), Arthrobacter nicotinovorans (X80743)와 하나의 cluster를 형성하였으며 NU15는 Arthrobacter nicotinovorans와 가장 가까운 관계를 보였으며, NU11은 이들 cluster에서 단일로 분류되었다.
- Meng 등(2010)은 니코틴이 260 nm 부근에서 특이적인 흡광을 한다고 보고하였다. 분리된 균주 NU11의 니코틴 분해 능력을 확인하기 위하여 니코틴을 포함한 배지에서 NU11 균주를 배양하면서 균의 성장에 따른 니코틴 분해를 분석하기 위해 UV 흡 광스펙트럼을 조사하였다(Fig. 3). NU11 균주는 유도기인 배양 2시간대에 니코틴에 아무런 변화를 주지 못하다가, 대수 초기인 배양 8시간에서 260 nm 부근의 니코틴 특이 흡광 파장부가 감소되었다.
- 분석된 16S rRNA 유전자의 부분적인 염기서열은 SeqMan 소프트웨어(DNASTAR)를 사용하여 조합하여 완성된 염기서열을 이용하여 근연관계의 미생물 종을 EzTaxon server (Kim et al., 2012)을 이용하여 찾았다.
- 선별된 균주의 계통분류학적 위치를 알아보기 위하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 콜로니를 20 µl의 멸균 증류수에 현탁시키고, 세균의 16S rRNA 유전자의universal primer인 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1492R (5′-TGA GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)을 사용하여 균주의 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다.
- 균주의 산 생산 유무, 탄소원 확인 및 여러 효소 생산의 확인을 위해 API 20NE, API 32GN을 사용하였다. 실험 방법과 결과 해석은 API kit 제조사에서 제공하는 사용 설명서를 따라 실행하였으며, 결과판독은 30℃에서 24시간과 48시간 때의 관찰을 바탕으로 이루어졌다.
- Gram 염색은 멸균된 20 µl의 증류수를 slide glass에 떨어뜨리고 멸균된 이쑤시개를 이용하여 MB/N 배지에서 3일간 배양한 균주의 콜로니를 취해 현탁시켜 준 다음 건조시켜 약한 화염에 2‒3회열 고정을 시켰다. 염색은 BD 사에서 제공하는 Grams staining kit (BD, USA)을 사용하여, 사용설명서에 따라 수행하였다.
- 3일간 배양시킨 후 자란 콜로니를 다시 새로운 MB/N 고체배지로 옮겨 30℃에서 3일간 4번의 계대배양을 통하여 순수분리를 하였다. 이 때, 배지에 색 변화를 보이는 콜로니들을 니코틴 분해 박테리아로 추정하고 이후의 실험을 진행하였다.
- 이러한 기존보고를 바탕으로 담배재배 토양과 담배의 잎, 줄기, 뿌리로부터 니코틴 분해 미생물을 분리하기 위하여 담배 재배지에서 채취한 샘플을 현탁하고, 희석하여 고체배지에서 색 변화를 보이는 균주들을 니코틴 분해능력을 가진 균주로 생각하여 분리하였다. 뿌리 주변의 토양에서 분리된 두 균주가 니코틴을 포함한 MB/N 한천배지 상에서 시간의 경과에 따라 무색에서 연한 노란색을 나타내다 최종 황색으로 변화를 보였고, 이들 균주를 각각 NU11, NU15라고 명명하였다(Fig.
- 일반적인 세포 형태를 관찰하기 위해 30℃에서 3일 동안 MB/N 배지에서 배양한 세균균주를 증류수에 적당량 희석하여 위상차 현미경(Nikon 80i, Japan)으로 1,500배 배율에서 관찰하였다. Gram 염색은 멸균된 20 µl의 증류수를 slide glass에 떨어뜨리고 멸균된 이쑤시개를 이용하여 MB/N 배지에서 3일간 배양한 균주의 콜로니를 취해 현탁시켜 준 다음 건조시켜 약한 화염에 2‒3회열 고정을 시켰다.
- 반응조건은 95℃에서 2분간 predenaturation을 거친 후 95℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 45초로 30회 반복 후 72℃에서 5분 동안 마지막 신장과정을 수행하였다. 증폭된 산물은 PCR purification kit (Real Biotech corp., Korea)를 이용하여 정제한 후 Solgent사(Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
- 침강물은 1 ml의 증류수를 이용해 재현탁 시킨 다음 UV spectrophotometer (Optizen 3220, Mecasys, Korea)로 흡광도 600 nm값을 측정하여 균의 증식을 확인하였고, 상등액은 100 µl를 2.9 ml 0.1 N HCl에 희석한 다음 파장 간격 1 nm로, 200‒350 nm 사이의 흡광도를 스캔하여 260 nm 파장대에서 니코틴 분해특이 파장을 확인하였다.
- 콜로니를 20 µl의 멸균 증류수에 현탁시키고, 세균의 16S rRNA 유전자의universal primer인 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3′)와 1492R (5′-TGA GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)을 사용하여 균주의 16S rRNA 유전자를 증폭시켰다.
- 본 실험에 사용된 토양 시료는 2010년 6월에 충청북도 청주시흥덕구 충북대학교 특용식물학과의 담배재배 하우스(36°37'49"N, 127°27'7"E)에서 채취하였다. 토양의 채취시 수분을 함유하고 있었으며, 담배 뿌리 주변토양과 담배의 잎, 줄기, 뿌리를 무균적으로 채취하여 멸균된 conical tube에 담아 운반하였다. 채취한 시료는 보관 기간 없이 바로 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 3 mg Na2SeO3 · 5H2O를 첨가하여 제조하였다. 니코틴은 Alfa Aesar (A Johonson Metthey 사)의 순도 99% (S)-(-)-Nicotine을 이용하였다.
- 미량원소는 1 L의 증류수에 3.0 g MgSO4 · 7H2O, 1.5 g nitrilotriacetic acid, 1.0 g CaCl2 · 2H2O, 1.0 g NaCl, 0.5 g MnSO4 · 2H2O, 0.18 g CoSO4 · 7H2O, 0.18 g ZnSO4 · 7H2O, 0.1 g FeSO4 · 7H2O, 0.025 g NiCl2 · 6H2O, 0.02 g KAI(SO4)2 · 12H2O, 0.01 g CuSO4 · 5H2O, 0.01 g H3BO3, 0.01 g Na2MoO4 · 2H2O, 0.3 mg Na2SeO3 · 5H2O를 첨가하여 제조하였다.
- 본 실험에 사용된 토양 시료는 2010년 6월에 충청북도 청주시흥덕구 충북대학교 특용식물학과의 담배재배 하우스(36°37'49"N, 127°27'7"E)에서 채취하였다.
데이터처리
- 선별균주와 근연종들의 16S rRNA 유전자 서열의 alignment는 Clustal X프로그램을 이용하였으며, 유전자 사이의 차이는 BioEdit 프로그램을 사용하여 편집 하였다. 계통도는 MEGA 3프로그램(Kumar et al.
이론/모형
- 선별균주와 근연종들의 16S rRNA 유전자 서열의 alignment는 Clustal X프로그램을 이용하였으며, 유전자 사이의 차이는 BioEdit 프로그램을 사용하여 편집 하였다. 계통도는 MEGA 3프로그램(Kumar et al., 2004)에서 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)으로 작성하였으며 branch의 신뢰도(bootstrap value)는 1,000회의 재구성된 자료로부터 새로운 tree를 작성하여 계산하였다.
성능/효과
- 담배식물과 담배재배 토양으로부터 최소배지에 유일 탄소원으로 니코틴을 첨가한 배지(MB/N)를 이용하여 니코틴을 분해하는 새로운 균주의 분리를 시도하였다. 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석과 표현형 시험 및 형태학적 시험으로 분리균주들은 Micrococcaceae 과의 Arthrobacter 속에 포함되는 균주로 판명되었다. NU15는 Arthrobacter nicotinovorans와 99.
- , 1992). Catalase와 oxidase 활성여부를 확인한 결과 두 균주 모두 거품을 발생시켜 catalase 양성이였지만, oxidase의 경우 색 변화를 관찰할 수 없어 음성인 것을 확인 할 수 있었다.
- 3). NU11 균주는 유도기인 배양 2시간대에 니코틴에 아무런 변화를 주지 못하다가, 대수 초기인 배양 8시간에서 260 nm 부근의 니코틴 특이 흡광 파장부가 감소되었다. 대수증식기 말기인 48시간에는 거의 절반의 니코틴이 분해되었고, 배양 72시간인 정지기 후기까지 지속적으로 흡광파장의 감소와 더불어 280‒320 nm에서 분해된 니코틴의 대사산물흡광이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다.
- 09%의 결과를 보여주었으며, 97% 이상의 상동성을 보인 type strain은 상기균을 포함하여 21종이었다. NU15는 A. nicotinovorans과 99.78%, A. histidinolovorans와 99.64%, A. nitroguajacolicus와 98.76%의 상동성을 보였으며 97% 이상의 상동성은 상기 균주를 포함 23주의 type strains이 존재하였다.
- 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석과 표현형 시험 및 형태학적 시험으로 분리균주들은 Micrococcaceae 과의 Arthrobacter 속에 포함되는 균주로 판명되었다. NU15는 Arthrobacter nicotinovorans와 99.8%의 상동 성을 보였고, NU11는 Arthrobacter equi와 98.2%의 상동성을 보여 신주일 가능성이 있었다. 두 균주 모두 양성의 간구균이며, catalase 양성, oxidase 음성이었다.
- 2). 그 결과 NU11 및 NU15 균주는 Arthrobacter nitroguaiacolicus (AJ512504), Arthrobacter histidinolovorans (X83406), Arthrobacter aurescens (X83405), Arthrobacter ureafaciens (X80744), Arthrobacter ilicis (X83407), Arthrobacter nicotinovorans (X80743)와 하나의 cluster를 형성하였으며 NU15는 Arthrobacter nicotinovorans와 가장 가까운 관계를 보였으며, NU11은 이들 cluster에서 단일로 분류되었다.
- NU11 균주는 유도기인 배양 2시간대에 니코틴에 아무런 변화를 주지 못하다가, 대수 초기인 배양 8시간에서 260 nm 부근의 니코틴 특이 흡광 파장부가 감소되었다. 대수증식기 말기인 48시간에는 거의 절반의 니코틴이 분해되었고, 배양 72시간인 정지기 후기까지 지속적으로 흡광파장의 감소와 더불어 280‒320 nm에서 분해된 니코틴의 대사산물흡광이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 배양 120시간에는 모든 니코틴이 분해되었고, 이로 인해 생성된 대사산물에 의해 형성된 파장 부분도 사라지는 것을 알 수 있었다.
- 2%의 상동성을 보여 신주일 가능성이 있었다. 두 균주 모두 양성의 간구균이며, catalase 양성, oxidase 음성이었다. 신주일 가능성이 있는 NU11균주의 니코틴 분해를 확인하기 위하여 MB/N 액체배지에서 배양하면서 니코틴 특이적으로 나타내는 260 nm에서의 흡광도가 감소를 측정한 결과, 니코틴이 균주에 의해 특이적으로 분해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 분해균들은 니코틴 오염을 복원하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 대수증식기 말기인 48시간에는 거의 절반의 니코틴이 분해되었고, 배양 72시간인 정지기 후기까지 지속적으로 흡광파장의 감소와 더불어 280‒320 nm에서 분해된 니코틴의 대사산물흡광이 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 배양 120시간에는 모든 니코틴이 분해되었고, 이로 인해 생성된 대사산물에 의해 형성된 파장 부분도 사라지는 것을 알 수 있었다. 이에 반해 균주를 접종하지 않은 배지 내 니코틴은 120시간까지 안정하게 유지되는 것을 보고(자료 미제시) 상기의 니코틴의 특이 흡광파장 감소가 NU11의 성장에 의한 분해결과 임을 알 수 있었다.
- 분리 균주들의 16S rRNA 유전자를 증폭하여 단편의 염기서열을 결정한 결과 NU11은 1,387 bp, NU15는 1.386 bp의 염기서열을 얻었고, GenBank에 각각 KJ170893, KJ170894로 등록하였다. 이들 서열을 이용하여 EzTaxon을 이용하여 type strain을 대상으로 상동성 조사를 한 결과 NU11은 Arthrobacter equi와 98.
- 분리된 두 균주의 생리화학적 특성분석 결과, NU11 균주가 urease의 활성을 가지는 반면, NU15 균주는 urease 활성이 없었다(Table 1). 반대로 phenylacetic acid의 경우 NU11은 이용할 수 없는 반면, NU15는 약하게 이용할 수 있었다.
- 이러한 기존보고를 바탕으로 담배재배 토양과 담배의 잎, 줄기, 뿌리로부터 니코틴 분해 미생물을 분리하기 위하여 담배 재배지에서 채취한 샘플을 현탁하고, 희석하여 고체배지에서 색 변화를 보이는 균주들을 니코틴 분해능력을 가진 균주로 생각하여 분리하였다. 뿌리 주변의 토양에서 분리된 두 균주가 니코틴을 포함한 MB/N 한천배지 상에서 시간의 경과에 따라 무색에서 연한 노란색을 나타내다 최종 황색으로 변화를 보였고, 이들 균주를 각각 NU11, NU15라고 명명하였다(Fig. 1).
- 두 균주 모두 양성의 간구균이며, catalase 양성, oxidase 음성이었다. 신주일 가능성이 있는 NU11균주의 니코틴 분해를 확인하기 위하여 MB/N 액체배지에서 배양하면서 니코틴 특이적으로 나타내는 260 nm에서의 흡광도가 감소를 측정한 결과, 니코틴이 균주에 의해 특이적으로 분해되는 것을 확인 할 수 있었으며, 분해균들은 니코틴 오염을 복원하는데 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 분리된 NU11과 NU15의 콜로니는 아이보리 색과 광택을 가지고 있으며, 가장자리는 완만한 형태를 가지고 있었다. 액체배지에서 3일간 배양한 NU11 및 NU15를 위상차 현미경으로 관찰한 결과 짧은 간균 또는 구균의 형태를 보여주었으며, Gram 염색 한 결과 두 균주 모두 보라색을 띠는 것으로 보아 Gram 양성 균으로 확인되었다(자료 미제시). Arthrobacter 속의 type species인 Arthrobacter globiformis은 배양초기의 젊은 세포는 Gram 음성의 간균, 배양 후기의 세포는 Gram 양성의 구균으로 보고 되어 있으며(Conn and Dimmick, 1947), A.
- 386 bp의 염기서열을 얻었고, GenBank에 각각 KJ170893, KJ170894로 등록하였다. 이들 서열을 이용하여 EzTaxon을 이용하여 type strain을 대상으로 상동성 조사를 한 결과 NU11은 Arthrobacter equi와 98.23%, A. ramosus와 98.17%, A. nitroguajacolicus와 98.09%의 결과를 보여주었으며, 97% 이상의 상동성을 보인 type strain은 상기균을 포함하여 21종이었다. NU15는 A.
- 이러한 상동성 및 계통 분석결과와 더불어 상기의 생리, 생화학적 시험결과를 종합해 보면 NU15는 A. nicotinovoran로 동정될 수 있다. 최근의 세균 종 분류는 두 종의 16S rRNA 유전자의 염기서열 차이가 1.
후속연구
- 본 연구에서 분리된 NU11 균주는 담배의 제조과정 중에 발생하는 니코틴 오염물을 생물학적으로 처리하는 데 사용할 수 있으며, 담배의 니코틴만을 선택적으로 감소시키는데 활용될 수 있을 것으로 생각되며, 기존의 종들과는 다른 새로운 종임을 입증하고 균주가 가진 니코틴 분해경로에 대한 추가 연구가 필요한 것으로 생각된다.
- nicotinovoran로 동정될 수 있다. 최근의 세균 종 분류는 두 종의 16S rRNA 유전자의 염기서열 차이가 1.0‒1.3%일 경우에는 DNA-DNA 혼성화 시험을 통해 종을 구분할 수 있으므로(Stackebrandt and Ebers, 2006) NU11은 신종의 가능성이 있으나, 신종의 유무를 판단하기 위해서는 표준균주들과 DNA-DNA 혼성화 시험, 지방산 분석 등의 자세한 연구가 요구된다.
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