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문제 정의
- 안지오텐신 길항제로서의 KR-31064를 표준물질들과 비교하기 위하여 IC50 수치를 도입하게 되었는데 이는 어떠한 리간드가 유효한 수용체 결합신호를 50% 억제하는 농도를 나타내는 것으로 다양한 리간드들의 비교를 위하여 필수적인 요소이며 이번 연구에서는 주로 KR-31064와 로자탄을 비교하기 위하여 사용하였다. IC50 수치의 변형이라고 할 수 있는 Ki(Ki=IC50/(1+L/Kd)) 수치는 IC50 결과로부터 실험에 사용된 리간드의 농도를 반영함으로써 계산하였다.
- 이와 같은 현황에 비추어 새롭게 개발된 KR-31064의 생리활성 기능에 대한 연구 내용을 수용체-리간드 측면에서 분석한 결과들을 중심으로, 안지오텐신 수용체에 작용하는 비펩타이드 리간드로서의 KR-31064에 대한 연구내용들을 보고하고자 한다.
제안 방법
- 수치를 도입하게 되었는데 이는 어떠한 리간드가 유효한 수용체 결합신호를 50% 억제하는 농도를 나타내는 것으로 다양한 리간드들의 비교를 위하여 필수적인 요소이며 이번 연구에서는 주로 KR-31064와 로자탄을 비교하기 위하여 사용하였다. IC50 수치의 변형이라고 할 수 있는 Ki(Ki=IC50/(1+L/Kd)) 수치는 IC50 결과로부터 실험에 사용된 리간드의 농도를 반영함으로써 계산하였다.17)
- KR-31064의 효과를 실험하기 위하여 서로 다른 농도에서(10-9, 3×10-9, 10-8 M) 30분간 처리한 혈관시료에 안지오텐신을 가하여 약물의 혈관수축 억제현상을 등장성 수축력을 기록하는 방식으로 측정하였다(Grass FT03, Grass Ins., 미국).
- 세포에서 생산된 수용체를 이용한 리간드의 결합특성 실험결과를 재확인하기 위하여 토끼의 대동맥을 이용한 혈관 수축실험이 도입되었다. 국내(삼육실험동물, 수원)에서 사육된 2~3 kg 정도의 뉴질랜드 흰토끼를 허가된 동물실험 절차에 따라 희생시키고 하부 가슴대동맥을 3~4 mm 폭을 가지는 링 형태로 잘라서 20 ml 용량의 조직수조에 넣고 크렙스 완충액(NaCl 118 mM, KCl 4.
- 신규로 개발된 안지오텐신 수용체 길항제인 KR-31064에 대한 수용체-리간드 결합특성을 연구하기 위하여 인간 유전자를 도입하여 생성한 AT1과 AT2 수용체에 대한 수용체 결합실험을 방사성 동위원소 리간드인 [125I] [Sar1, Ile8]-AII을 사용하여 분석하고, 실제 혈관샘플인 토끼 대동맥을 사용한 혈관 수축실험을 통하여 그 효과와 특성을 검증하였다. KR-31064는 수용체 결합실험 결과로 현재 AT1 수용체 길항제의 표준물질인 로자탄보다 18배 이상 더 강력한 길항효과를 나타내었으며, 로자탄과 유사한 AT1 수용체에 대한 선택성과 경쟁적 길항제 패턴을 보여주었다.
- 4)을 혼합가스(95% O2, 5% CO2)와 함께 37oC에서 유지하였다. 실험에 사용된 혈관링은 2g의 장력으로 90분간 평형화 시켰으며 다양한 안지오텐신 농도(10-10~10-5 M)에 의한 농도의존적 수축현상을 모니터하기 위하여 각 농도의 안지오텐신이 처리된 이후 혈관조직은 적어도 3차례 이상 완충액으로 세척하였다. KR-31064의 효과를 실험하기 위하여 서로 다른 농도에서(10-9, 3×10-9, 10-8 M) 30분간 처리한 혈관시료에 안지오텐신을 가하여 약물의 혈관수축 억제현상을 등장성 수축력을 기록하는 방식으로 측정하였다(Grass FT03, Grass Ins.
- 실험완충용액(50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4)과 함께 각각의 방사성동위원소리간드를 96웰을 갖춘 미소판 플랫폼에서 시험약물과 37℃에서 60분간 반응시킨 후(AT2 수용체의 경우는 180분) 0.3% polyethylenimine에 충분히 적셔놓은 유리섬유 필터 GF/C를 통하여 여과하였다. 여과시 차가운 50 mM 농도의 Tris buffer(pH 7.
- 3% polyethylenimine에 충분히 적셔놓은 유리섬유 필터 GF/C를 통하여 여과하였다. 여과시 차가운 50 mM 농도의 Tris buffer(pH 7.4)가 사용되었으며 여과와 세척이 끝난 필터는 고형증진제를 첨가하여 측정기(MicroBeta, PerkinElmer life and analytical sciences, 미국)에서 동위원소 총량을 측정하였다. 각 수용체 결합실험의 최소 신호는 10 µM 농도의 [Sar1, Ile8]-AII를 같이 반응시켜 얻을 수 있었다.
대상 데이터
- [Sar1, Ile8]-Angiotensin II, Angiotensin II(AII) acetate, arterenol bitartarate, vasopressin acetate, isoproterenol hydrochloride들은 Sigma Chemical Co.(미국)를 통하여 구입하였으며, 방사성동위원소 리간드인 [125I] [Sar1, Ile8]-AII와 [125I] CGP 42112A(2200 Ci/mmol), 수용체 시약인 human recombinant AT1 and AT2 receptor들은 PerkinElmer life and analytical sciences(미국)으로부터 구입하여 사용하였다. KR-31064와 로자탄은 dimethyl sulfoxide에 용해하여 사용하였으며 최종 희석액은 안지오텐신 수용체 결합실험에 사용한 완충액을 사용하였다.
- 과 같은 방법으로 진행하였다. AT1 수용체와 AT2 수용체에 대한 리간드들의 선택적 활성을 연구하기 위하여 사용한 방사성동위원소가 표지된 리간드에 의한 수용체 결합실험 방법은, 0.21 nM의 [125I] [Sar1, Ile8]-AII와 0.5 nM of [125I] CGP 42112A가 표지 리간드로 사용되었다. KR-31064를 포함하여 실험에 사용된 합성물질들은 최초 2.
- 5 nM of [125I] CGP 42112A가 표지 리간드로 사용되었다. KR-31064를 포함하여 실험에 사용된 합성물질들은 최초 2.5 mM 농도로 dimethylsulfoxide에 녹인 후 완충액을 사용하여 10개의 다른 농도로 연쇄희석하여 사용하였다.
- (미국)를 통하여 구입하였으며, 방사성동위원소 리간드인 [125I] [Sar1, Ile8]-AII와 [125I] CGP 42112A(2200 Ci/mmol), 수용체 시약인 human recombinant AT1 and AT2 receptor들은 PerkinElmer life and analytical sciences(미국)으로부터 구입하여 사용하였다. KR-31064와 로자탄은 dimethyl sulfoxide에 용해하여 사용하였으며 최종 희석액은 안지오텐신 수용체 결합실험에 사용한 완충액을 사용하였다.
- 세포에서 생산된 수용체를 이용한 리간드의 결합특성 실험결과를 재확인하기 위하여 토끼의 대동맥을 이용한 혈관 수축실험이 도입되었다. 국내(삼육실험동물, 수원)에서 사육된 2~3 kg 정도의 뉴질랜드 흰토끼를 허가된 동물실험 절차에 따라 희생시키고 하부 가슴대동맥을 3~4 mm 폭을 가지는 링 형태로 잘라서 20 ml 용량의 조직수조에 넣고 크렙스 완충액(NaCl 118 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 2.5 mM, NaHCO3 25 mM, MgSO4 1.2 mM, KH2PO4 1.2 mM, glucose 11.0 mM, pH 7.4)을 혼합가스(95% O2, 5% CO2)와 함께 37oC에서 유지하였다. 실험에 사용된 혈관링은 2g의 장력으로 90분간 평형화 시켰으며 다양한 안지오텐신 농도(10-10~10-5 M)에 의한 농도의존적 수축현상을 모니터하기 위하여 각 농도의 안지오텐신이 처리된 이후 혈관조직은 적어도 3차례 이상 완충액으로 세척하였다.
- 동위원소 리간드인 [125I] [Sar1, Ile8]-AII를 이용한 수용체 포화결합 실험은 KR-31064를 1 nM 처리한 수용체를 사용하였으며 표준물질로 10 nM 로자탄을 처리한 수용체를 비교목적으로 같이 실험하였다. 실험결과 도출된 수용체 포화결합 데이터를 Scatchard 방법으로 전환하여 포물선이 아닌 직선으로 수용체-리간드 결합특성을 분석한 결과 Fig.
- 비교분석에 필요한 표준물질로는 로자탄(10-7, 3×10-7, 10-6 M)을 사용하였으며, 실험결과의 정량적인 수치로 pKB(pKB=[antagonist]/(dose ratio-1)) 값을 쉴드공식으로 변환한 pA2 값을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과로 나타낸 모든 자료는 평균값에 대한 표준오차(mean±S.E.M.)를 나타낸 것으로 이러한 자료들은 컴퓨터 소프트웨어인 GraphPad사의 PRISM을 사용하여 직선형 회귀법 및 비직선형 회귀법으로 계산하였다.
이론/모형
- KR-31064의 안지오텐신 수용체에 대한 리간드로서의 결합특성을 연구하기 위하여 적용한 방법은 이미 개발된 피리딘 이미다졸 시리즈의 다른 화합물들에 대한 연구논문16)과 같은 방법으로 진행하였다. AT1 수용체와 AT2 수용체에 대한 리간드들의 선택적 활성을 연구하기 위하여 사용한 방사성동위원소가 표지된 리간드에 의한 수용체 결합실험 방법은, 0.
성능/효과
- AT1 수용체 유전자를 발현시킨 수용체를 사용하여 [125I] [Sar1, Ile8]-AII를 결합시켜 얻은 포화반응곡선을 분석한 결과, 분리상수 값(Kd)이 0.24±0.01 nM로 단일 수용체와 결합하는 것으로 나타났으며 전체 수용체 결합사이트는 mg 단백질 당 46.3±0.7 fmol로 나타났다.
- Fig. 2에 표시한 바와 같이 AT1 수용체에 대하여 KR-31064, 로자탄, L-158809은 농도의존적으로 0.21 nM의 [125I] [Sar1, Ile8]-AII 결합을 저해하였으며, 특히 KR-31064는 PD-123177이 억제효과(IC50=4.3±1.4 µM)를 보인 AT2 수용체에 대하여 전혀 저해효과를 나타내지 못하고 AT1 수용체에 대해서만 강력한 결합 억제효과(IC50=0.67±0.10 nM)를 나타내었다.
- KR-31064(10-9, 3×10-9 and 10-8 M)는 농도에 따라 반응 그래프가 오른쪽으로 이동되는 전형적인 반응 결과를 나타내었으나 최고 수축반응이 각 농도에서 25.5, 29.1, 33.1% 감소하는 효과를 보였다(계산된 pKB: 9.86±0.13).
- KR-31064는 로자탄(IC50=12.30±1.42 nM)과 비교하여 약 18.4배 정도의 우수한 억제효과를 나타내었으며 L-158809(IC50=1.44±0.34 nM)보다도 더 강력한 수용체 결합억제 효과를 나타내었다.
- ]-AII을 사용하여 분석하고, 실제 혈관샘플인 토끼 대동맥을 사용한 혈관 수축실험을 통하여 그 효과와 특성을 검증하였다. KR-31064는 수용체 결합실험 결과로 현재 AT1 수용체 길항제의 표준물질인 로자탄보다 18배 이상 더 강력한 길항효과를 나타내었으며, 로자탄과 유사한 AT1 수용체에 대한 선택성과 경쟁적 길항제 패턴을 보여주었다. 하지만 생체 조직인 토끼 혈관을 이용한 혈관 수축실험에서는 로자탄과 달리 사전 처리한 KR-31064의 농도에 따라 최대 혈관수축반응의 감소현상이 관찰되었다.
- KR-31064와 로자탄은 안지오텐신이 반응하는 혈관수축효과를 농도의존적으로 억제하였으며 수용체 결합실험에서의 작용패턴과는 상이한 현상이 발견되었다(Fig. 4). KR-31064(10-9, 3×10-9 and 10-8 M)는 농도에 따라 반응 그래프가 오른쪽으로 이동되는 전형적인 반응 결과를 나타내었으나 최고 수축반응이 각 농도에서 25.
- )를 나타낸 것으로 이러한 자료들은 컴퓨터 소프트웨어인 GraphPad사의 PRISM을 사용하여 직선형 회귀법 및 비직선형 회귀법으로 계산하였다. 결과분석에 사용된 모든 실험결과는 최소한 3개 이상의 반복 샘플로 3회 이상 측정되었다.
- ]-AII를 이용한 수용체 포화결합 실험은 KR-31064를 1 nM 처리한 수용체를 사용하였으며 표준물질로 10 nM 로자탄을 처리한 수용체를 비교목적으로 같이 실험하였다. 실험결과 도출된 수용체 포화결합 데이터를 Scatchard 방법으로 전환하여 포물선이 아닌 직선으로 수용체-리간드 결합특성을 분석한 결과 Fig. 3과 같이 X축의 일정 지점에서 각 포화직선이 만나게 되는 결과를 보여 결론적으로 KR-31064와 로자탄은 전체 수용체 결합사이트를 변화시키지 않고 리간드의 수용체에 대한 친화도만 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 친화도 증가효과는 KR-31064의 경우 2.
- 34 nM)보다도 더 강력한 수용체 결합억제 효과를 나타내었다. 억제곡선 그래프를 분석한 결과 Hill 상수는 KR-31064, 로자탄, L-158809 각각 0.98, 0.85, 0.99로 계산되어 전체 실험결과의 데이터 포인트들이 계산된 곡선에 잘 부합하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 하지만 생체 조직인 토끼 혈관을 이용한 혈관 수축실험에서는 로자탄과 달리 사전 처리한 KR-31064의 농도에 따라 최대 혈관수축반응의 감소현상이 관찰되었다. 이상의 실험결과를 종합하면 KR-31064는 AT1 수용체에 선택적으로 작용하는 강력한 길항제로 매우 효과적인 혈관 수축억제 기능을 나타내었으며 이러한 수용체-리간드 결합특성을 응용하여 향후 비침습 진단방법의 개발을 위한 표지 리간드로서의 응용 가능성이 매우 크다고 판단된다.
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