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문제 정의
- 항생제는 효능이 우수하더라도 시간이 지나면 내성이 생기는데, 천연 약물을 이용한다면 내성문제를 해결할 수 있을 것이라 생각된다. 따라서 본 연구에서는 항톡소포자충 효과가 있는 한약재를 파악하고자 하였다.
제안 방법
- 1×105개의 톡소포자충의 영양형을 4주령 ICR mouse 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다.
- 배양기에서 배양하였다. 6시간 후, 2%의 FBS 가 함유된 배지로 교환 및 톡소포자충 영양형은 HeLa 세포주의 5배를 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다.
- 6시간 후, 2%의 FBS 가 함유된 배지로 교환 및 톡소포자충 영양형은 HeLa 세포주의 5배를 처리하였다. 그 후 24시간 동안 배양한 뒤, 배지를 교환함과 동시에 천연물을 농도별로 처리하였다. 이때 대조군으로서 설파다이아진(Sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany)을 사용하였다.
- 이러한 이유로 톡소포자충에 대한 새로운 치료제의 개발 필요성이 대두되고 있으며, 합성 화학약물들에 비교하여 부작용이 적고 안전성이 높은 천연물들을 원료로 한 톡소포자충의 치료가 모색되고 있다(Ferreira, 2006). 본 연구에서는 HeLa cell을 이용하여 선택성(selectivity)의 수치를 구하고, 수치가 높으면 안전성이 높은 것으로 판단하여 항톡소포자충의 효과가 있는 천연물들을 스크리닝하였다. 연구 결과, 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제적으로 사용되고 있는 설파디아진(Sulfadiazine sodium salt)의 선택성 2.
- 이렇게 얻은 상층액을 새로운 50 mL tube에 옮겨서 2400 RPM에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 얻은 순수한 톡소포자충 영양형을 실험에 제공하였다.
- 본 실험에 사용된 한약재는 동의보감과 중의약대 사전에서 전통적으로 항기생충 약재나 항 염증에 사용되는 13가지의 한약재를 선정하였으며, 익산시 신용동 소재 대학한약국에서 구입하여 사용하였다(Table 1). 한약재는 분말 시료로 100 g을 70% 에탄올 수용액 600 mL에 100℃에서 2시간 동안 가온 환류 추출하여 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 추출하였다. 추출물은 실험 직전까지 4℃에 보관하여 사용하였다.
대상 데이터
- HeLa 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 공급받았고, 96 well에 9×103/mL 되게 접종하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2배양기에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 한약재는 동의보감과 중의약대 사전에서 전통적으로 항기생충 약재나 항 염증에 사용되는 13가지의 한약재를 선정하였으며, 익산시 신용동 소재 대학한약국에서 구입하여 사용하였다(Table 1). 한약재는 분말 시료로 100 g을 70% 에탄올 수용액 600 mL에 100℃에서 2시간 동안 가온 환류 추출하여 여과한 후, 회전감압농축기(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축 하여 추출하였다.
데이터처리
- 각 시험군의 유의성에 대한 통계는 대조군과 실험군 간의 통계학적 비교를 위해 SPSS 17.0 (SPSS INC., Chicago, USA)를 사용하여 분석하였으며, 실험군과 대조군의 비교는 student’s t-test를 이용하여 분석하였고, P＜0.05 이하일 때 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.
- 실험을 통하여 얻어진 모든 결과는 평균±표준편차 (mean±SD)로 나타내었다.
이론/모형
- 이때 대조군으로서 설파다이아진(Sulfadiazine sodium salt, SIGMA, S6387, Germany)을 사용하였다. 24시간 뒤 세포증식분석으로 EZ-Cytox Kit WST-1(Daeil Lab.Co., Korea)을 처리하고, 15분 후, 흡광광도계로 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하여, 시그모이달 커브(sigmoidal curve)를 작성한 후 톡소포자충의 증식을 억제하는 농도 EC50(50% 세포증식억제 농도)를 산출하였고, 항톡소플라즈마 효과에 대한 약효판정은 Kim 등(2008)의 방법에 따라서 선택성(selectivity)을 구하여 보다 높은 선택성을 가진 물질이 항톡소플라즈마 효과가 있는 것으로 판정하였다. 선택성을 구하는 식은 다음과 같았다.
- 본 실험에 사용된 톡소포자충(RH strain of Toxoplasma gondii, ATCC No.50174)의 빠른분열소체(tachyzoite)의 배양은 Song 등(2004)의 방법에 따라서 ICR mouse 암컷 마우스(female mouse)의 복강내 배양방법을 실시하였다. 1×105개의 톡소포자충의 영양형을 4주령 ICR mouse 암컷 마우스 복강에 주입한 뒤, 4일 후 마우스를 경추탈골 하였다.
성능/효과
- 1 μg/mL를 처리한 군과 10μg/mL 처리한 군의 경우 대조군보다 세포의 생존도가 높았으나, 100 μg/mL 처리한 군과 200 μg/mL 처리한 군에서는 톡소포자충에 감염된 헬라세포의 생존도가 유의하게 감소함을 볼 수 있었다(Fig. 1) (P＜0.05).
- 52)로 현재 톡소플라즈마 치료 약제인 설파디아제(Sulfadiazine sodium salt)보다 높은 선택성을 나타내었다. Table 2와 같이 한약재 13종 중에서 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)가 가장 높은 선택성 7.52를 나타내었다(Table 2).
- 대조군보다 더 높은 선택성을 보인 익지인, 계혈등, 백선피 추출물 중 백선피 추출물을 1∼200 μg/mL의 다양한 농도별로 처리하고, 24시간 동안 배양한 결과 세포의 생존도는 용량과 시간에 의존적으로 현저하게 감소하였다(P＜0.05).
- 08의 선택성을 보였다. 대조군보다 더 높은 선택성을 보인 한약재는 익지인(2.75), 계혈등(2.96), 백선피(7.52)로 현재 톡소플라즈마 치료 약제인 설파디아제(Sulfadiazine sodium salt)보다 높은 선택성을 나타내었다. Table 2와 같이 한약재 13종 중에서 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)가 가장 높은 선택성 7.
- 본 연구에서는 HeLa cell을 이용하여 선택성(selectivity)의 수치를 구하고, 수치가 높으면 안전성이 높은 것으로 판단하여 항톡소포자충의 효과가 있는 천연물들을 스크리닝하였다. 연구 결과, 톡소포자충의 치료제로 임상에서 실제적으로 사용되고 있는 설파디아진(Sulfadiazine sodium salt)의 선택성 2.08 보다 높은 선택성을 가진 2.75의 익지인(Alpinia oxyphylla), 2.96의 계혈등(Mucunae Caulis), 7.52의 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)으로, 백선피 추출물의 선택성이 매우 높은 것으로 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 익지인(Alpinia oxyphylla), 계혈등(Mucunae Caulis), 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz) 추출물은 톡소포자충의 치료제로서 효능과 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다.
- 52의 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz)으로, 백선피 추출물의 선택성이 매우 높은 것으로 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 익지인(Alpinia oxyphylla), 계혈등(Mucunae Caulis), 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz) 추출물은 톡소포자충의 치료제로서 효능과 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 향후 톡소포자충 치료에 항생제를 대체할 수 있는 천연물 추출물로 개발 될 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 이러한 결과로부터 익지인(Alpinia oxyphylla), 계혈등(Mucunae Caulis), 백선피(Dictamnus dasycarpus Turcz) 추출물은 톡소포자충의 치료제로서 효능과 안정성이 우수한 것을 알 수 있었다. 이러한 결과로 향후 톡소포자충 치료에 항생제를 대체할 수 있는 천연물 추출물로 개발 될 수 있을 것으로 사료된다.
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