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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우슬을 이용한 우슬차 및 우슬식혜 개발 연구의 일환으로, 국내산 토우슬과 중국산 회우슬의 열수 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제하여 각각의 유용성분을 분석하고, 추출물 및 분획물의 in-vitro 항균 활성, 항산화 활성 및 항당뇨 활성을 비교하여 보고하는 바이다.
제안 방법
- α-glucosidase 저해활성은 pNPG (p-nitrophenol glucoside; Sigma Co., USA)를 이용하여 평가하였으며[22], 우슬 시료 2.5μl와 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase (0.25 U/ml) 25 μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 하고 1 mM pNPG 용액 25 μl를 가하여 60℃에서 10분간 반응하였다.
- 유기용매 분획물 제조의 경우, 각각의 우슬 열수 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 물 잔류물을 회수하였으며[1], 각각의 분획물들은 감압 건조하여 분말화하였다. 각각의 시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, in-vitro 항균 활성, 항산화 활성 및 항당뇨 활성 평가에 사용하였다. 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co.
- 국내산 토우 슬은 2011년 경북 영천에서 가을에 수확, 건조한 제품이며, 중국산 회우슬은 2011년 중국 하남성에서 가을에 수확, 건조한 제품이다. 각각의 우슬은 추출에 적합하도록 세절한 후 증류수를 우슬 무게의 20배가 되도록 첨가하여 100℃에서 2시간 추출하였으며, 상기 추출을 3회 반복하였다. 이후 추출액은 filter paper (Whatsman No.
- 대조구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole (Sigma Co., USA)을 각각 1 μg/disc의 농도로 사용하였으며, 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 mm 단위로 측정하였고, 3회 이상 평가후 대표 결과로 나타내었다.
- 먼저 αamylase 저해활성은 Lim 등[22]의 방법을 수정하여 사용하였으며, 우슬 시료 2.5 μl와 50 mM phosphate buffer (pH 6.8)로 희석한 α-amylase (0.25 U/ml) 25 μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation한 후, 0.5% soluble starch (Samchun Chemicals Co., Korea) 25 μl를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응하였다.
- , USA) 용액을 첨가하여 100℃에서 5분간 가열하여 발색한 후 상온에서 방냉하였다. 발색액은 96 well microplate reader(Tecan Co., USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 실험은 3회 반복한 후 평균값을 구하여 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.
- , Zurich, Switzerland)로 측정하였으며, 추출물의 pH 측정은 320 pH meter (Mettler Toledo InLabR 413, UK)로 측정하였다. 색차 측정은 색차계(Chromatometer CR-300, Minota, Japan)을 이용하여 백색도(L value, lightness), 적색도(a value, redness) 및 황색도(b value, yellowness) 값을 3회 반복 측정하여 색차(E)를 계산하였다. 표준 백색판은 L값이 92.
- 우슬의 수분함량은 적외선 수분측정기(HG53 Halogen Moisture Analyzer, Mettler-Toledo International Inc., Zurich, Switzerland)로 측정하였으며, 추출물의 pH 측정은 320 pH meter (Mettler Toledo InLabR 413, UK)로 측정하였다. 색차 측정은 색차계(Chromatometer CR-300, Minota, Japan)을 이용하여 백색도(L value, lightness), 적색도(a value, redness) 및 황색도(b value, yellowness) 값을 3회 반복 측정하여 색차(E)를 계산하였다.
- , USA)를 첨가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA (%)는 다음의 식에 의해 계산하였다[21].
- 전분분해 저해활성은 활성은 in-vitro α-amylase 저해 활성과 α-glucosidase 저해 활성을 평가하여 나타내었다.
- 조제된 우슬 열수 추출물 및 분획물은 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항산화 활성을 평가하였으며, 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) anion 소거능, 2,2-azobis (3-ethylbenzothiazoline6-sulfonate) (ABTS) cation 소거능 및 환원력을 측정하여 평가 하였다[26]. 대조구로는 vitamin C (Sigma Co.
- 5 ml를 넣어 반응을 종료하고 1,000 g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액을 0.1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 환원력을 평가하였다[21].
대상 데이터
- 조제된 우슬 열수 추출물 및 분획물은 dimethylsulfoxide(DMSO)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 항산화 활성을 평가하였으며, 항산화 활성은 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) anion 소거능, 2,2-azobis (3-ethylbenzothiazoline6-sulfonate) (ABTS) cation 소거능 및 환원력을 측정하여 평가 하였다[26]. 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 이상 반복한 실험의 mean ± SD로 표시하였으며, 소거능 평가에서 50%의 소거능이 나타나는 시료 농도를 IC50로 나타내었다.
- 본 실험에 사용된 국내산 토우슬과 중국산 회우슬은 2012년 안동지역의 대제한약에서 구입하여 사용하였다. 국내산 토우 슬은 2011년 경북 영천에서 가을에 수확, 건조한 제품이며, 중국산 회우슬은 2011년 중국 하남성에서 가을에 수확, 건조한 제품이다.
- (MO, USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 우슬은 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2012- WS1, 2012-WS2).
- 총 polyphenol 함량은 추출검액 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[25]. 표준시약으로는 tannic acid (Sigma Co., MO, USA)를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[27].
- 조제된 우슬의 열수 추출물 및 이의 분획물의 항균 활성은 기존의 보고된 방법과 동일하게 평가하였다[11]. 항세균 활성 평가를 위한 그람 양성세균으로는 Staphylococcus aureus KCTC 1916, Listeria monocytogenes KACC 10550, Bacillus subtilis KCTC 1924를 사용하였으며, 그람 음성세균으로는 Escherichia coli KCTC 1682, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926를 사용하였고, 항진균 활성 평가를 위해서는 Candida albicans KCTC 1940및 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233를 사용하였다. 항세균 활성 평가의 경우, Nutrient broth (Difco Co.
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 20.0 버전을 사용하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다.
이론/모형
- , MO, USA)를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[27]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.
- 한편 추출물의 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법[25]에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출검액 400 μl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.
성능/효과
- 토우슬 및 회우슬의 분획물에서는 모두 ethylacetate 분획에서 강력한 DSA 및 ASA를 나타내었으며, 나머지 분획물의 항산화 활성은 미미하였다. 가장 강력한 항산화 활성은 토우슬 ethylacetate 분획에서 나타났으며, ASA 경우 0.5 mg/ml 농도에서 vitamin C (0.01 mg/ml)에 필적하는 강력한 활성을 나타내었으며, DSA의 경우 0.5 mg/ml의 농도에서 vitamin C (0.01 mg/ml)에 비해 2배의 활성을 나타내었다. 환원력 평가의 경우에도, 토우슬 ethylacetate분획에서 강력한 활성이 나타났으며, 0.
- 1%인 점을 고려하면[21], 우슬의 열수 추출효율은 ethanol 추출에 비해 약 10배 이상 높음을 알 수 있었다. 각각의 열수 추출물의 pH는 5.43~5.63으로 유사하였으나, 색차의 경우 토우슬에서 회우슬에 비해 상대적으로 낮은 명도, 적색도 및 높은 황색도를 나타내어 색차는 토우슬에서 49.2, 회우슬에서는 41.5를 나타내었다. 토우슬과 회우슬의 열수 추출물의 순차적 유기용매 분획 효율 및 성분 분석 결과는 Table 2에 나타내었다.
- 먼저대조구로 사용된 ampicillin과 miconazole은 다양한 병원성 세균, 식중독 세균 및 진균에 우수한 항균활성을 나타내었다. 각각의 우슬 열수 추출물과 분획물 중 가장 많은 양을 차지하는 물 잔류물은 항균 활성이 나타나지 않았다. 분획물 중 토우 슬의 ethylacetate 분획(500 μg/disc)에서는 대장균을 제외한 모든 세균에 대해 약한 항균력을 나타내었으며, n-hexane분획에서는 Bacillus subtilis에서만 항균력이 나타났다.
- 각각의 활성 평가는 각각 3회 이상 반복한 실험의 mean ± SD로 표시하였으며, 소거능 평가에서 50%의 소거능이 나타나는 시료 농도를 IC50로 나타내었다.
- 2배 강한 활성을 나타내었다. 따라서 우슬의 열수 추출물의 경우, 메탄올 추출물[31] 또는 에탄올 추출물[21]과는 달리, 토우슬이 회우슬보다 우수한 항산화력을 가지고 있음을 확인하였다. 한편 우슬 추출물 및 이의 분획물의 NSA 평가 결과는 Table 5에 나타내었으며, 항산화력 평가와 유사하게 각각의 추출물의 ethylacetate 분획에서 가장 양호한 활성을 나타내었 으며, 특히 토우슬의 ethylacetate 분획(0.
- 본 연구결과는 국내에서 동일 약재로 사용되고 있는 토우슬과 회우슬의 열수 추출물들은 추출효율과 성분에서 많은 차이가 있으며, 특히 이들의 분획물의 경우 성분 및 활성이 더욱 차이가 나타남을 제시하고 있다. 따라서 우슬의 항균, 항산화 및 항당뇨 활성을 이용한 천연물 신약 개발시에는 국내산 토우슬의 ethylacetate 분획이 적합하며, 우슬차 및 우슬식혜 제조시에는 토우슬의 열수 추출물이 적합함을 확인하였다.
- 반면 회우슬의 n-hexane분획에서는 대장균을 제외한 그람음성 세균 및 Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성이 나타났으며, ethylacetate 분획에서는 Proteus vulgaris에 대한 활성이 나타났다. 따라서 토우슬에서는 ethylacetate 분획이, 회우슬에서는 n-hexane분획이 다양한 항균활성 물질을 포함하고 있음을 알수 있었다.
- 87 mg/g (물 잔류물)의 분포를 보였으며, 이러한 특성은 환원당 함량분석에서도 동일하게 나타났다. 따라서 회우슬이토우슬보다 수용성 당류 및 다양한 폴리페놀 성분을 더욱 많이 함유하고 있음을 확인하였다.
- 먼저 임상에서 사용되고 있는 acarbose (Sigma Co., MO, USA)는 0.1 mg/ml 의 저농도에서 α-amylase 및 α-glucosidase 활성을 49.4% 및 55.2% 저해하여 우수한 항당뇨 활성을 확인하였다.
- 토우슬 및 회우슬의 열수 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 항균활성 평가 결과는 Table 3에 나타내었다. 먼저대조구로 사용된 ampicillin과 miconazole은 다양한 병원성 세균, 식중독 세균 및 진균에 우수한 항균활성을 나타내었다. 각각의 우슬 열수 추출물과 분획물 중 가장 많은 양을 차지하는 물 잔류물은 항균 활성이 나타나지 않았다.
- 분획물 중 토우 슬의 ethylacetate 분획(500 μg/disc)에서는 대장균을 제외한 모든 세균에 대해 약한 항균력을 나타내었으며, n-hexane분획에서는 Bacillus subtilis에서만 항균력이 나타났다. 반면 회우슬의 n-hexane분획에서는 대장균을 제외한 그람음성 세균 및 Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성이 나타났으며, ethylacetate 분획에서는 Proteus vulgaris에 대한 활성이 나타났다. 따라서 토우슬에서는 ethylacetate 분획이, 회우슬에서는 n-hexane분획이 다양한 항균활성 물질을 포함하고 있음을 알수 있었다.
- 특히 우수한 α-amylase 저해활성은 토우슬 및 회우슬의 ethylacetate 분획에서 나타났으나, αglucosidase 저해활성은 각각의 butanol 분획에서 나타나 다양한 저해활성물질이 존재함을 확인하였다. 본 연구결과는 국내에서 동일 약재로 사용되고 있는 토우슬과 회우슬의 열수 추출물들은 추출효율과 성분에서 많은 차이가 있으며, 특히 이들의 분획물의 경우 성분 및 활성이 더욱 차이가 나타남을 제시하고 있다. 따라서 우슬의 항균, 항산화 및 항당뇨 활성을 이용한 천연물 신약 개발시에는 국내산 토우슬의 ethylacetate 분획이 적합하며, 우슬차 및 우슬식혜 제조시에는 토우슬의 열수 추출물이 적합함을 확인하였다.
- 분획물 중 토우 슬의 ethylacetate 분획(500 μg/disc)에서는 대장균을 제외한 모든 세균에 대해 약한 항균력을 나타내었으며, n-hexane분획에서는 Bacillus subtilis에서만 항균력이 나타났다.
- 분획물의 경우 모든 분획물에서 유사한 α-amylase 및α-glucosidase 저해활성을 나타내었고, 토우슬의 경우 0.5 mg/ml 농도에서 각각 8.1~15.4% 및 9.3~11.6%의 저해활성을 나타내었으며, 회우슬의 경우 각각 11.3~20.7% 및 -1.9~15.8%의 저해활성을 나타내었다.
- 5%의 NSA를 나타내었다. 이러한 결과는 우슬 열수 추출물이 다양한 nitrite 소거활성 물질을 함유하고 있음을 의미하며, 우슬을 이용한 식품의 nitrite 소거제 개발이 가능함을 암시한다.
- 4배 높은 특성을 보였다. 총당 분석 결과, 토우슬의 모든 분획에서는 153.32(n-hexane 분획)~382.27 mg/g (butanol 분획)의 함량 분포를 나타낸 반면 회우슬의 경우 9.86 (n-hexane 분획) ~554.87 mg/g (물 잔류물)의 분포를 보였으며, 이러한 특성은 환원당 함량분석에서도 동일하게 나타났다. 따라서 회우슬이토우슬보다 수용성 당류 및 다양한 폴리페놀 성분을 더욱 많이 함유하고 있음을 확인하였다.
- 먼저 열수 추출물의 경우 토우슬이 회우슬보다 우수한 DSA 및 ASA를 나타내어 우슬의 유기용매 추출물과는 다른 결과를 나타내었다[21, 31]. 토우슬 및 회우슬의 분획물에서는 모두 ethylacetate 분획에서 강력한 DSA 및 ASA를 나타내었으며, 나머지 분획물의 항산화 활성은 미미하였다. 가장 강력한 항산화 활성은 토우슬 ethylacetate 분획에서 나타났으며, ASA 경우 0.
- 토우슬 및 회우슬의 수분함량은 각각 9.13% 및 10.89%로 회우슬이 1.7% 정도 수분함량이 높았으나, 열수 추출 효율은 토우슬이53.9%로 회우슬의 47.6%보다 높았다(Table 1). 토우슬 및 회우슬의 ethanol추출효율이 5.
- 토우슬의 열수 추출물은 회우슬 추출물보다 우수한 α-amylase 저해활성을 나타내었으나, α-glucosidase 저해활성은 유사하였다.
- 토우슬과 회우슬의 열수 추출물의 순차적 유기용매 분획 효율 및 성분 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 토우슬의경우 n-hexane과 ethylacetate 분획의 총량이 1.4%로 매우 미미하였으며, 77%는 물 잔류물로 나타나 토우슬의 열수 추출물의 대부분이 수용성 당류임을 알 수 있었다. 회우슬의 경우에도 이와 유사하게 n-hexane과 ethylacetate 분획의 총량이 0.
- 특히 우수한 α-amylase 저해활성은 토우슬 및 회우슬의 ethylacetate 분획에서 나타났으나, αglucosidase 저해활성은 각각의 butanol 분획에서 나타나 다양한 저해활성물질이 존재함을 확인하였다.
- 한편 분획물의 총플라보노이드 및 총폴리페놀 함량 분석결과, 토우슬 및 회우슬 모두에서 ethylacetate 분획에서 가장 높은 함량을 나타내었으나, 회우슬 분획에서 토우슬 분획보다총플라보노이드 및 총폴리페놀 함량이 각각 3.3배 및 7.4배 높은 특성을 보였다. 총당 분석 결과, 토우슬의 모든 분획에서는 153.
- 2%로 나타났다. 한편 열수 추출물의 총당및 환원당 함량은 회우슬 추출물이 토우슬보다 각각 1.86 및 1.1배 높은 함량을 나타내었으며, 총폴리페놀 및 총플라보노이드 함량은 회우슬 추출물이 토우슬보다 각각 1.58 및 9.3배 높은 함량을 나타내었다. 관능성의 경우 우슬 특유의 향과 맛은 토우슬이 우수하였으며, 회우슬의 경우 단맛이 너무 강하였다.
- 따라서 우슬의 열수 추출물의 경우, 메탄올 추출물[31] 또는 에탄올 추출물[21]과는 달리, 토우슬이 회우슬보다 우수한 항산화력을 가지고 있음을 확인하였다. 한편 우슬 추출물 및 이의 분획물의 NSA 평가 결과는 Table 5에 나타내었으며, 항산화력 평가와 유사하게 각각의 추출물의 ethylacetate 분획에서 가장 양호한 활성을 나타내었 으며, 특히 토우슬의 ethylacetate 분획(0.1 mg/ml)은 대조구로 사용된 vitamin C (0.01 mg/ml) 보다 우수한 활성을 나타내었다. 토우슬의 경우 기타 다른 분획물(0.
- 01 mg/ml)에 비해 2배의 활성을 나타내었다. 환원력 평가의 경우에도, 토우슬 ethylacetate분획에서 강력한 활성이 나타났으며, 0.5 mg/ml 농도에서 회우슬의 ethylacetate 분획보다 3.2배 강한 활성을 나타내었다. 따라서 우슬의 열수 추출물의 경우, 메탄올 추출물[31] 또는 에탄올 추출물[21]과는 달리, 토우슬이 회우슬보다 우수한 항산화력을 가지고 있음을 확인하였다.
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