동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 의 expressed sequence tags (ESTs) 로부터 분리한 2종류의 Serpin 유전자 분석 Identification and in silico analysis of two types of serpin genes from expressed sequence tags (ESTs) of the Oriental land snail, Nesiohelix samarangae원문보기
동양달팽이의 EST 에서 serpin 유전자는 2가지 type이 추정되었다. Ns-serpin type 1 (partial) 서열의 코딩 영역은 총 819 bp 이었으며, 272개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, Ns-serpin type 2 (partial) 의 코딩영역은 총 555 bp, 185개의 아미노산으로 이루어져 있었다. Laminarin 처리 전에는 Ns-serpin type 1이 2개 발현되었으며 처리 후에는 Ns-serpin type 2가 1개 발현되고 있었다. BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 17개의 참고 서열과 동양달팽이의 Ns-serpin type 1, 2의 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 척색동물인 해초강, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다. Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다. 본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역과 연관이 있는 것으로 잘 알려진 두 종류의 serpin 유전자 서열을 동양달팽이 EST 결과에서 발굴 하였으며, 동양달팽이에서도 여러 가지 type의 serpin 이 존재 할 수 있음을 입증하였다.
동양달팽이의 EST 에서 serpin 유전자는 2가지 type이 추정되었다. Ns-serpin type 1 (partial) 서열의 코딩 영역은 총 819 bp 이었으며, 272개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, Ns-serpin type 2 (partial) 의 코딩영역은 총 555 bp, 185개의 아미노산으로 이루어져 있었다. Laminarin 처리 전에는 Ns-serpin type 1이 2개 발현되었으며 처리 후에는 Ns-serpin type 2가 1개 발현되고 있었다. BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 17개의 참고 서열과 동양달팽이의 Ns-serpin type 1, 2의 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 척색동물인 해초강, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다. Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다. 본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역과 연관이 있는 것으로 잘 알려진 두 종류의 serpin 유전자 서열을 동양달팽이 EST 결과에서 발굴 하였으며, 동양달팽이에서도 여러 가지 type의 serpin 이 존재 할 수 있음을 입증하였다.
Serpins are a group of proteins involved in the regulation of serine and other type of proteases, and have been identified in many kinds of organisms from invertebrates to vertebrates. Serpins are known to regulate the proteolytic cascades of the innate immune pathways in addition to their roles in ...
Serpins are a group of proteins involved in the regulation of serine and other type of proteases, and have been identified in many kinds of organisms from invertebrates to vertebrates. Serpins are known to regulate the proteolytic cascades of the innate immune pathways in addition to their roles in blood coagulation, angiogenesis, fibrinolysis, inflammation and tumor suppression. In this study, we have isolated two partial serpin gene fragments from expressed sequence tags (ESTs) of Nesiohelix samarangae. Dotplot analysis indicates that they are of two different types, Ns-serpin type 1 and Ns-serpin type 2. Ns-serpin type 1 has 819 bp coding region (272 amino acids), whereas Ns-serpin type 2 has 555 bp coding region (185 amino acids). Molecular phylogenetic analysis shows that the identified serpins have high similarities to their counterparts in the California see slug, Aplysia californica. Yet, the precise biological and immunological roles of these Ns-serpins remain to be further investigated using RNA interference and other molecular techniques.
Serpins are a group of proteins involved in the regulation of serine and other type of proteases, and have been identified in many kinds of organisms from invertebrates to vertebrates. Serpins are known to regulate the proteolytic cascades of the innate immune pathways in addition to their roles in blood coagulation, angiogenesis, fibrinolysis, inflammation and tumor suppression. In this study, we have isolated two partial serpin gene fragments from expressed sequence tags (ESTs) of Nesiohelix samarangae. Dotplot analysis indicates that they are of two different types, Ns-serpin type 1 and Ns-serpin type 2. Ns-serpin type 1 has 819 bp coding region (272 amino acids), whereas Ns-serpin type 2 has 555 bp coding region (185 amino acids). Molecular phylogenetic analysis shows that the identified serpins have high similarities to their counterparts in the California see slug, Aplysia californica. Yet, the precise biological and immunological roles of these Ns-serpins remain to be further investigated using RNA interference and other molecular techniques.
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문제 정의
본 연구는 동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 를 이용하여 immune elicitor 인 laminarin을 처리한 실험군 및 그렇지 않은 대조군으로 나누어 각각의 cDNA 라이브러리를 제작한 후 random sequencing을 실시하고 분석하여 두 가지군으로부터 얻어진 서열을 비교 발현유전체학적으로 분석하여 laminarin 처리 전 후 발현의 변화를 보인 serpin 유전자를 선정한 후 유전자의 염기서열 및 아미노산 염기서열을 규명하고, EST 내에 몇 가지 type의 serpin이 존재하는지 규명하여 선천성 면역 관련 연구의 기초를 마련하고자 하였다.
제안 방법
6490) is shown. Initial tree(s) for the heuristic search were obtained automatically by applying Neighbor-Join and BioNJ algorithms to a matrix of pairwise distances estimated using a JTT model, and then selecting the topology with superior log likelihood value. The tree is drawn to scale, with branch lengths measured in the number of substitutions per site.
74104) 를 사용하여 total mRNA를 정제한 후 oligo dT와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA 를 합성한 후 Stratagene cDNA Library Construction Kit 사용하여 cDNA library를 구축하였다. LD-PCR 법과 primer extention 법 두 가지를 사용하여 double-strand cDNA를 합성한 후 Lambda TriplEx2 vector에 ligation 시킨 후 Gigapack Gold Ⅲ (Stratagene, LaJolla, Calif.) packaging system을 사용하여 packaging 을 하였다.
Laminarin 처리 후 증감이 관찰 되어진 유전자 후보군에서 serine peptidase inhibitor, clade B (Serpin 3) 유전자로 annotation 되어진 서열은 cap3 프로그램을 통하여 assembly 하여 contig를 작성하였으며 Genscan 프로그램을 사용하여 아미노산 서열을 추출하였다.
8을 이용하여 lamda linear form의 TriplEx2를 circular form 의 pTriplEx2로 전환한 후 LB agar plate (cabenicilline) 에 plating 한 후 37℃에서 24시간 배양하였다. NucleoGen Plasmid Purification Kit를 사용하여 Plasmid를 정제한 후에 Sequencing을 위해 자동염기서열분석기 (AB-3730XL, Applied biosystems) 를 사용하여 염기서열을 결정하였다.
순수하게 정제 되어진 수용성의 laminarin 100 μl / ml 를 3시간 처리한 실험군과 아무것도 처리하지 않은 대조군 각각에 대해 cDNA library를 구축하였다. 각각의 동양달팽이를 해부 현미경하에서 소화관을 제거한 뒤 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Cat.No. 74104) 를 사용하여 total mRNA를 정제한 후 oligo dT와 reverse transcriptase를 사용하여 cDNA 를 합성한 후 Stratagene cDNA Library Construction Kit 사용하여 cDNA library를 구축하였다. LD-PCR 법과 primer extention 법 두 가지를 사용하여 double-strand cDNA를 합성한 후 Lambda TriplEx2 vector에 ligation 시킨 후 Gigapack Gold Ⅲ (Stratagene, LaJolla, Calif.
구축되어진 각각의 cDNA library를 random sequencing하여 생성되어진 chromatopherogram 파일은 phred score 20 이상의 조건으로 base calling 한 후 pTriplEX2 서열 및 cross_match를 활용한 vector masking 및 EMBOSS 패키지의 trimest 프로그램을 활용한 poly-A tail 제거 작업을 수행하였다. 이러한 작업을 통해 확보된 clean mFASTA 형태의 서열은 nr 데이터베이스 및 동양달팽이 전용데이터베이스 (http://www.
단백질의 2차 구조 분석을 위해 genscan 프로그램을 이용하여 확보되어진 아미노산 서열을 Psipred 프로그램을 활용하여 2D 구조를 예측하였으며, 3D-jigsaw 프로그램을 활용하여 단백질 3차 구조를 modeling 하였다.
동양달팽이의 serpin 유전자를 in silico 스크리닝하기 위하여 NCBI 에서 mouse 의 serpin 유전자 274 type (isoform 포함) 전체를 다운로드 받은 후 query 서열로 하여 동양달팽이 전용 데이터베이스 (http://www.edunabi.com/~nsdb) 에 설치되어져 있는 laminarin 처리 전후의 EST DB에 tBLASTn 프로그램을 활용하여 스크리닝 하였다. 추출되어진 동양달팽이의 serpin 서열을 클러스트링 및 어셈블리 하여 type 별로 분류한 후 BLAST 프로그램 및 NCBI nr 데이터베이스를 활용하여 연체동물 문에 속하는 생물 및 기타생물들의 관련 참고서열을 추출하였으며, homology가 가장 높은 아미노산 서열을 선택하여 관련 참고서열로 활용하였다 (Braun, Pedretti et al.
순수하게 정제 되어진 수용성의 laminarin 100 μl / ml 를 3시간 처리한 실험군과 아무것도 처리하지 않은 대조군 각각에 대해 cDNA library를 구축하였다.
구축되어진 각각의 cDNA library를 random sequencing하여 생성되어진 chromatopherogram 파일은 phred score 20 이상의 조건으로 base calling 한 후 pTriplEX2 서열 및 cross_match를 활용한 vector masking 및 EMBOSS 패키지의 trimest 프로그램을 활용한 poly-A tail 제거 작업을 수행하였다. 이러한 작업을 통해 확보된 clean mFASTA 형태의 서열은 nr 데이터베이스 및 동양달팽이 전용데이터베이스 (http://www.edunabi.com/~nsdb) 에 설치되어져 있는 BLAST 프로그램을 이용하여 annotation 작업을 실시하였으며 laminarin 처리 후 증감이 있는 유전자 후보군 리스트를 확보하였다.
com/~nsdb) 에 설치되어져 있는 laminarin 처리 전후의 EST DB에 tBLASTn 프로그램을 활용하여 스크리닝 하였다. 추출되어진 동양달팽이의 serpin 서열을 클러스트링 및 어셈블리 하여 type 별로 분류한 후 BLAST 프로그램 및 NCBI nr 데이터베이스를 활용하여 연체동물 문에 속하는 생물 및 기타생물들의 관련 참고서열을 추출하였으며, homology가 가장 높은 아미노산 서열을 선택하여 관련 참고서열로 활용하였다 (Braun, Pedretti et al. 2001). 추출된 참고서열들을 MEGA6 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar 2004, Edgar 2004).
대상 데이터
All positions containing gaps and missing data were eliminated. There were a total of 134 positions in the final dataset. Evolutionary analyses were conducted in MEGA6 (Tamura, Stecher et al.
본 연구에 사용되어진 동양달팽이 (Nesiohelix samarangae) 는 충청남도 태안군 근흥면 가의도에서 채집하였으며 mRNA를 추출하기 위해 72시간 이전부터 먹이를 주지 않은 채 단기간 사육하여 실험에 사용하였다.
이론/모형
Molecular phylogenetic analysis of Ns-serpin type 1 and Ns-serpin type 2. The evolutionary history was inferred by using the Maximum Likelihood method based on the JTTmatrix-based model (Jones, Taylor et al. 1992). The tree with the highest log likelihood (-4098.
추출된 참고서열들을 MEGA6 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar 2004, Edgar 2004). 그후 Maximum Likelihood method based on the JTT matrix-based model method를 통해 phylodendrogram을도식화하였다 (Jones, Taylor et al. 1992, Tamura, Peterson et al. 2011).
2001). 추출된 참고서열들을 MEGA6 프로그램의 clustalW 모듈을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행하였다 (Edgar 2004, Edgar 2004). 그후 Maximum Likelihood method based on the JTT matrix-based model method를 통해 phylodendrogram을도식화하였다 (Jones, Taylor et al.
성능/효과
Laminarin 처리 전에는 Ns-serpin type 1이 2개 발현되었으며 처리 후에는 Ns-serpin type 2가 1개 발현되고 있었다. BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 17개의 참고 서열과 동양달팽이의 Ns-serpin type 1, 2의 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 척색동물인 해초강, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다. Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다.
Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다. 본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역과 연관이 있는 것으로 잘 알려진 두 종류의 serpin 유전자 서열을 동양달팽이 EST 결과에서 발굴하였으며, 동양달팽이에서도 여러 가지 type의 serpin 이 존재 할 수 있음을 입증하였다.
4에서 보여지는 바와 같이 Ns-serpin type 1 및 type 2의 아미노산 서열을 포함하여 17개의 생물종에서 보존되어진 부분이 여러군데에서 발견되었다. Fig. 5의 phylodendrogram에서 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 해초강 1종, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다 (Table 1).
Ns-serpin type 1과 type 2의 dotplot 분석 결과 Ns-serpin type 1과 Ns-serpin type 2는 일부 유사한 서열을 가지고 있으나 서로 다른 서열임이 확인되었다 (Fig. 3). 또한 BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 참고서열과 동양 달팽이의 serpin 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment를 수행한 후 Maximum Likelihood method based on the JTT matrix-based model method를 통해 phylodendrogram을 도식화한 결과 Fig.
BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 17개의 참고 서열과 동양달팽이의 Ns-serpin type 1, 2의 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment 를 수행한 결과, 척색동물의 포유강 9종, 조류강 1종, 양서강 1종과 척색동물인 해초강, 절지동물의 거미강 1종과 곤충강 1종이 같은 군으로 묶였으며, 연체동물문의 경우 동양달팽이의 두 가지 type 을 포함한 복족강 4종이 같은 군으로 묶이는 것을 확인하였다. Psipred 프로그램을 활용하여 예측한 2D 구조도 multiple align 및 phylodendrogram 결과와 연관이 있음을 확인할 수 있었다. EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다.
그 후 단백질의 2차 구조 분석을 위해서 Genscan 프로그램을 이용하여 확보되어진 아미노산 서열을 Psipred 프로그램을 활용하여 2D 구조를 예측한 결과 type 1 sepin (A)의 경우 α-Helix 구조는 서열상에서 5개 영역으로 예측되었고 β-pleated sheet 구조는 서열상에서 16개 영역으로 예측되었으나, type 2 serpin (B)의 경우에는 4개의 α-Helix 구조와 9개 영역의 β-pleated sheet 구조를 서열상에서 가지는 것으로 예측되어 구분되었다 (Fig. 6).
3). 또한 BLAST 결과를 바탕으로 유사도가 높은 참고서열과 동양 달팽이의 serpin 아미노산 서열을 MEGA6 프로그램의 clustalW 엔진을 이용하여 multiple sequence alignment를 수행한 후 Maximum Likelihood method based on the JTT matrix-based model method를 통해 phylodendrogram을 도식화한 결과 Fig. 4에서 보여지는 바와 같이 Ns-serpin type 1 및 type 2의 아미노산 서열을 포함하여 17개의 생물종에서 보존되어진 부분이 여러군데에서 발견되었다. Fig.
본 연구에서 밝혀진 동양달팽이의 2가지 type의 serpin은 laminarin 처리 전에는 type 1에 해당하는 2개의 클론이 처리 후에는 type 2에 해당하는 클론이 1개 발견되어 서로 type이 달랐다. 이러한 관점에서 향후 유전자침묵 (gene silencing) 기술인 RNA interference 방법을 이용하여 Ns-serpin 1, 2를 knock-down 한 후 동양달팽이에 다양한 미생물 (그람음성균, 그람양성균, 곰팡이) 을 감염하여 mortality를 조사함으로써 Ns-serpin type 1과 Ns-serpin type 2의 구체적인 면역학적 기능을 구명할 수 있을 것으로 사료된다.
EST를 통해 밝힌 동양달팽이의 두 가지 type의 Ns-serpin 서열은 Aplysia californica 등의 근연종들의 서열과 유사하였다. 본 연구에서는 무척추동물에서의 선천성 면역과 연관이 있는 것으로 잘 알려진 두 종류의 serpin 유전자 서열을 동양달팽이 EST 결과에서 발굴하였으며, 동양달팽이에서도 여러 가지 type의 serpin 이 존재 할 수 있음을 입증하였다.
6). 예측된 2차 구조를 바탕으로 3D-jigsaw 프로그램을 활용하여 단백질 3차 구조를 modeling 한 결과에서도 2가지 type의 serpin이 상이한 3차 구조를 가지는 것으로 예측되었다 (Fig. 7).
후속연구
본 연구에서 밝혀진 동양달팽이의 2가지 type의 serpin은 laminarin 처리 전에는 type 1에 해당하는 2개의 클론이 처리 후에는 type 2에 해당하는 클론이 1개 발견되어 서로 type이 달랐다. 이러한 관점에서 향후 유전자침묵 (gene silencing) 기술인 RNA interference 방법을 이용하여 Ns-serpin 1, 2를 knock-down 한 후 동양달팽이에 다양한 미생물 (그람음성균, 그람양성균, 곰팡이) 을 감염하여 mortality를 조사함으로써 Ns-serpin type 1과 Ns-serpin type 2의 구체적인 면역학적 기능을 구명할 수 있을 것으로 사료된다.
이처럼 선천성 면역 반응을 연구하는데 있어 후천성 면역체계가 없는 무척추동물을 이용하는 것은 선천성 면역 반응을 이해하는데 유용한 것으로 보여진다. 현재 많이 활용되고 있는 곤충뿐만 아니라 연체동물과 같은 무척추동물 및 포유류, 조류 및 양서류의 척삭동물의 선천성 면역에 중요한 기능을 갖는 효소로 척추동물과 무척추동물의 선천성 면역 사이의 관계 연구에 유용한 대상이 될 것으로 여겨진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Serpin은 무엇이며 어떤 역할을 하는가?
Serpin은 다양한 기능을 갖는 protease inhibitor superfamily로서 처음 그 기능이 규명된 serine proteases inhibitors에서 그 이름이 유래되었으며 serine protease의 활성을 억제하여 immune pathway의 negative regulator 로 선천성 면역에 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다 (Wei, Yang et al. 2012).
동양달팽이 EST에서 serpin 유전자 2가지 type은 각각 어떻게 구성되는가?
동양달팽이의 EST 에서 serpin 유전자는 2가지 type이 추정되었다. Ns-serpin type 1 (partial) 서열의 코딩 영역은 총 819 bp 이었으며, 272개의 아미노산으로 이루어져 있었으며, Ns-serpin type 2 (partial) 의 코딩영역은 총 555 bp, 185개의 아미노산으로 이루어져 있었다. Laminarin 처리 전에는 Ns-serpin type 1이 2개 발현되었으며 처리 후에는 Ns-serpin type 2가 1개 발현되고 있었다.
caspases와 cathespins 같은 일부 serpin은 어디에도 영향을 미치는가?
2014). 대부분의 serpin이 serine proteases를 억제하지만 caspases와 cathespins과 같은 일부의 serpin은 cysteine proteases를 억제하며 호르몬 전달과 혈압조절에도 영향을 미친다고 알려져 있다 (Silverman, Bird et al. 2001).
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