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문제 정의
- 이 연구의 최종 목적은 식품등이 박테리아에 감염되었을 경우, 특정 박테리아 - T7 박테리오파지의 경우 E.Coli - 에만 결합하여 그 박테리아를 용해시키고 2차적으로 생성되어 외부로 노출된 박테리오파지를 정량분석함으로써 간접적으로 감염원인 박테리아를 검출하는 것이다. 따라서 개발한 전기 영동 고정화 시스템을 사용하여 용액으로부터 박테리오파지를 분리하고 광 결정 나노 구조화 어레이에 고정화시킴으로 파지의 고감도 검출이 가능하게 된다.
- -노이즈를 생성하는 비특이적(nonspecific) 시그널을 감소시키고 시그널 대 노이즈 비율을 증가시키기 위한 별도의 시간 소비적인 과정 (예: washing)이 요구된 다. 이에 우리는 이러한 단점을 극복하고 바이오 센서에 광 결정 효과를 극대하하기 위한 방법을 개발하였다.[1]
제안 방법
- 광 결정구조의 최적화는 아래 위상 정합 (phase matching)식을 이용하여 전자기복사 (electromagnetic radiation)과 나노구조가 상호작용을 할 수 있도록 이루어졌다. 결과적으로 주어진 파장값과 웰 크기 (40 nm)에서, 웰간의 간격을 350 nm로 설계하고 어레이를 가공하였을때 (자세한 과정 생략) 입자-면 역복합체가 고정되어있는 웰 내부 바닥과 주변에 최적으로 형성된 전자기를 얻을 수 있었다(Figure 7).
- Coli - 에만 결합하여 그 박테리아를 용해시키고 2차적으로 생성되어 외부로 노출된 박테리오파지를 정량분석함으로써 간접적으로 감염원인 박테리아를 검출하는 것이다. 따라서 개발한 전기 영동 고정화 시스템을 사용하여 용액으로부터 박테리오파지를 분리하고 광 결정 나노 구조화 어레이에 고정화시킴으로 파지의 고감도 검출이 가능하게 된다. 이때 검출 시그널은 박테리아파지 내부의 DNA에 삽입 /결합된 형광염료 (intercalating fluorescent dye)로 부터 생성된다.
- 면역복합체의 고정 후 10-3pg/mL-109pg/mL의 9가지 Rabbit-IgG와 형광 물질이 부착되어있는 2차 antiRabbit IgG를 반응시켜 표준곡선 (standard curve)를 산출하였다. 형광 물질은 532 nm 파장의 레이져에 반응하여 555 nm의 빛을 방출하는 것을 사용하였다.
- 본문에서 소개할 광 결정(photonic crystal) 나노 구조화 어레이(nanostructured array)는 나노입자 (nanoparticle)와 결합한 면역복합체 (immunocomplex)를광 결정구조속에 삽입함으로써 나노스케일화 되어있는 일반 나노 바이오센서의 모든 장점과 더불어 감도를 극대화시킬 수 있게 되었다. 이 새로운 형태의 면역플랫폼(immunoplatform)은 간단하고, 저렴하며 나노스케일의 표면 기능화 (functionalized)된 어래이 생성의 대안을 제시한다.
- 우선 전기 영동 구속 시스템을 사용하여 입자-면역 복합체를 나노웰 (nanowell)과 마이크로 웰 (microwell)에 고정하여 면역 반응 플렛폼의 구조 변화에서 발생하는 시그널의 차이를 실험해보았다. 샘플속에 있는 항원에 반응할 항체가 고정화될 입자의 크기와 웰간의 간격 (periodicity)를 조절함으로써 항체가 고정화될 표면적을 동일화시켰다. 사용된 입자의 크기는 40 nm, 200 nm, 1 μm, 5 μm였고 그에 따른 웰간의 간격은 650 nm, 2 μm, 10 μm, 0 μm로 어레이를 제작하였다.
- 이 입자 기반의 면역복합체를 이용할 경우 빠른 시간에 광범위한 면적에 반응 생체 분자를 고정시킬 수 있고 다른 환경적 요소의 제약 없이 쉽게 생체 분자를 원하는 표면에 고정화시킬 수 있는 장점이 있다. 여기서 우리는 이러한 장점을 응용하여 음성 하전된 입자 (negatively charged particle)의 표면에 생체 분자 (항체 도는 DNA probe oligo)부착하고 이 후 형성된 입자-면역복합체를 양전하를 형성한 표면으로 이동시키는 방법을 개발하였다.[6] 이 방법을 이용하여 우리는 하전된 나노입자-면역복합체를 그에 상응하는 크기의 나노 구조화된 어레이내부로 고정화하는데 성공하였다.
- 우선 전기 영동 구속 시스템을 사용하여 입자-면역 복합체를 나노웰 (nanowell)과 마이크로 웰 (microwell)에 고정하여 면역 반응 플렛폼의 구조 변화에서 발생하는 시그널의 차이를 실험해보았다. 샘플속에 있는 항원에 반응할 항체가 고정화될 입자의 크기와 웰간의 간격 (periodicity)를 조절함으로써 항체가 고정화될 표면적을 동일화시켰다.
- 본문에서 소개할 광 결정(photonic crystal) 나노 구조화 어레이(nanostructured array)는 나노입자 (nanoparticle)와 결합한 면역복합체 (immunocomplex)를광 결정구조속에 삽입함으로써 나노스케일화 되어있는 일반 나노 바이오센서의 모든 장점과 더불어 감도를 극대화시킬 수 있게 되었다. 이 새로운 형태의 면역플랫폼(immunoplatform)은 간단하고, 저렴하며 나노스케일의 표면 기능화 (functionalized)된 어래이 생성의 대안을 제시한다.
- 어레이에서 디텍터 방향으로의 1차 회절을 유도함으로써 여기 (excitation)와 발산 (emission)을 극대화할수 있게 되었다. 이렇게 최적화된 광 결정 나노 어레이 플랫폼을 이용하여 실제 생체 분자물질을 검출하였다.
- 전기 영동 구속 시스템은 생체 분자 고정화에 나노 스케일의 정밀성을 부여하였고 더불어 간편하면서도 효율적이어서 표면 고정화에 기반을 두고 있는 어레이 형태의 바이오 센서의 범용적 실현화에 혁신적인 방법을 제시한다.
- 전기 영동 구속 시스템을 이용하여 실제 면역 반응 검출을 나노 어레이에서 실행하였다. 검출 대상 물질은 3-phenoxybenzoic acid로써 살충제 (insecticide)에 사용되는 환경 독성물질인 pyrethroid의 생체 지표 (biomarker)이다.
- 전기 영동 사용을 통해 박테리오파지를 직접적으로 어레이에 배열시켰다.[15] 이 실험에 사용된 박테리오파지의 종류는 T7으로 불리는것으로 머리의 크기가 60 nm, 꼬리의 길이가 23 nm로 이다.
대상 데이터
- DNA-광 결정 나노 구조화 어레이 플랫폼의 실현성이 실제 샘플인 PKD를 지닌 고양이의 혈액과 소변 샘플을 사용하여 테스트 되었다. 그 결과 한계 검출 농도는 0.
- 전기 영동 구속 시스템을 이용하여 실제 면역 반응 검출을 나노 어레이에서 실행하였다. 검출 대상 물질은 3-phenoxybenzoic acid로써 살충제 (insecticide)에 사용되는 환경 독성물질인 pyrethroid의 생체 지표 (biomarker)이다. 이 지표는 극소 분자로써 일반적인 면역분석방식이 적용 불가능하여 합텐 (hapten)을 이용한 competitive 면역분석 방법을 이용하였다.
- 입자-DNA probe oligo가 전기 영동 입자 구속 시스템을 통해 광 결정 내부로 고정하고 샌드위치 hybridization과정을 통해 feline polycystic kidney disease를 유발하는 돌연변이의 1 base pair 차이를 확인할 수 있었다. 검출에 이용된 DNA oligo는 PKD의 SNP를 포함할수 있도록 합성된 것이었다. 한계 검출 농도는 0.
- pg/mL)의 HER2가 사용되었으며 실험의 실제성을 입증하기 위해 25%의 인체 혈청(human serum)이 용액의 일부로 사용되었다. 또한 비교 검증을 위해 일반적으로 진단에 이용되는 면역분석 법인 ELISA의 실험 데이터가 사용되었다. 검출 결과 기존의 면역분석 방법 또는 센서들과 비교화여 개발된 광결정 나노 구조화 어레이에서는 혈청 또는 기타 다른 요인들로 부터 생성되는 비특이성 또는 배경 시그널들이 극히 작았으며 검출 한계 농도 또한 10-6ng/mL (10attomolar)로 기존의 ELISA를 사용하여 얻어낸 감도보다 106배 향상된 것이었다 (Figure 8).
- 본 실험에서는 서론 다른 다섯가지의 농도 (10-3, 1,103,104,105,106,107pg/mL)의 HER2가 사용되었으며 실험의 실제성을 입증하기 위해 25%의 인체 혈청(human serum)이 용액의 일부로 사용되었다. 또한 비교 검증을 위해 일반적으로 진단에 이용되는 면역분석 법인 ELISA의 실험 데이터가 사용되었다.
- Figure 1은 개발된 전기 영동 입자 구속 시스템 (electrophoretic particle entrapment system)의 개념도와 더불어 이 시스템상에서 형성된 전기장과 그에 따른 입자의 이동 경로, 그리고 시스템을 이용하여 200 nm 입자를 어레이 내부의 웰 (well)속으로 구속화한 것을 형광이미지를 사용하여 보여주고 있다. 사용된 어레이는 서로 다른 굴절률을 지닌 물질들 (PMMA: 1.48, ITO: 1.8, glass: 1.52)로 구성되어있어 어레이 내부에서 내부 전반사 (total internal reflection)가 발생하도록 제작되었다.
- 사용된 입자의 크기는 40 nm, 200 nm, 1 μm, 5 μm였고 그에 따른 웰간의 간격은 650 nm, 2 μm, 10 μm, 0 μm로 어레이를 제작하였다.
- pg/mL의 9가지 Rabbit-IgG와 형광 물질이 부착되어있는 2차 antiRabbit IgG를 반응시켜 표준곡선 (standard curve)를 산출하였다. 형광 물질은 532 nm 파장의 레이져에 반응하여 555 nm의 빛을 방출하는 것을 사용하였다. 그결과 40 nm (well size)-650 nm (periodicity)의 경우가 각각의 농도에 따라 가장 큰 시그널 값을 보였으며 검출 농도 한계 또한 1 pg/mL으로 1 μm-10 μm, 5 μm-0 μm의 것보다 감도에서 각각 103,106배 각각 향상된 것이다 (Figure 5).
이론/모형
- SEB의 검출을 위해 개발한 입자-기반 광 결정 나노 구조와 어레이가 사용되었고 형광 시그널 검출 기반의 샌드위치 면역분석법이 적용되었다.[14] 우선 phosphate buffered saline (PBS)에 용해된 SEB를 검출 대상 물질로 사용하여 실험을 한 결과 검출 한계 농도는 10-9μg/mL (35 attomolar) 이었으며 일반적으로 사용되는 96-well-ELISA의 감도와 비교하였을 때 106배 향상된 것이었다(Figure 9).
- 검출 대상 물질은 3-phenoxybenzoic acid로써 살충제 (insecticide)에 사용되는 환경 독성물질인 pyrethroid의 생체 지표 (biomarker)이다. 이 지표는 극소 분자로써 일반적인 면역분석방식이 적용 불가능하여 합텐 (hapten)을 이용한 competitive 면역분석 방법을 이용하였다. Figure 2는 합텐이 부착된 200 nm-입자를 전기 영동 구속 시스템을 이용하여 어레이 내부로 고정화한 후 서로 다른 농도 (0 μg/L, 0.
- 또한 나노 입자-면역 복합체를 원하는 센싱 장소로 제어/고정화시킬 수 있다면 불필요한 샘플 소비를 억제할 수 있다. 이러한 장점때문에 우리는 광 결정 바이오 센서에 앞서 개발한 전기 영동 구속 시스템을 사용하였다.
성능/효과
- 센서에 응용될 다양한 면역분석법들, 셀 하나의 반응에서 오는 작은 시그널이라도 검출하고 변형할 수 있는 변환기와 디텍터들, 시그널을 효과적으로 읽고 분석하는 리더들 등 센서를 이루는 주요 요소들은 나름의 획기적인 발전을 이루어가고 있으며 역시 이러한 향상된 검출 요소들의 기반위에 바이오센서가 추구해 나가야 할 방향은 현장 적용성과 경제성으로 압축되고 있다. 개발된 광 결정 나노 구조화 어레이는 면역분석법과 DNA분석으로 이원화된 분석 방법을 통합하고 범용적인 사용을 가능케 하며, 광 결정 구조에서 기인한 플렛폼 자체의 시그널 향상으로 인해 기존의 복잡하고 스케일이 큰 디텍터와 리더가 필요치 않음으로 인해 바이오 센서가 나가야 할 최종목적에 가장 근접한 센서의 타입이다.
- 또한 비교 검증을 위해 일반적으로 진단에 이용되는 면역분석 법인 ELISA의 실험 데이터가 사용되었다. 검출 결과 기존의 면역분석 방법 또는 센서들과 비교화여 개발된 광결정 나노 구조화 어레이에서는 혈청 또는 기타 다른 요인들로 부터 생성되는 비특이성 또는 배경 시그널들이 극히 작았으며 검출 한계 농도 또한 10-6ng/mL (10attomolar)로 기존의 ELISA를 사용하여 얻어낸 감도보다 106배 향상된 것이었다 (Figure 8).
- 광 결정구조의 최적화는 아래 위상 정합 (phase matching)식을 이용하여 전자기복사 (electromagnetic radiation)과 나노구조가 상호작용을 할 수 있도록 이루어졌다. 결과적으로 주어진 파장값과 웰 크기 (40 nm)에서, 웰간의 간격을 350 nm로 설계하고 어레이를 가공하였을때 (자세한 과정 생략) 입자-면 역복합체가 고정되어있는 웰 내부 바닥과 주변에 최적으로 형성된 전자기를 얻을 수 있었다(Figure 7).
- 005 ng/mL이었으며 이는 단일 어레이가 혈액과 소변 샘플에서 추출된 6 femtogram의 genomic DNA 검출할 수 있음을 보여주었다. 광 결정 나노 구조화 어레이를 통해 얻어진 감도는 DNA 분석을 위해 일반적으로 이용되고 그 성능이 입증된 real time-polymerase chain reaction (PCR)방법의 그것과 유사하였고 반면, 분석시간, 경제성, 현장 적용성등에서 오히려 향상된 DNA 분석 방법임을 입증하였다.
- 광 결정 나노 구조화 어레이의 실제 적용성을 평가하기 위해 우유속에 포함된 SEB를 검출하였으며 PBSSEB의 표준 곡선과 비교해 보았을 때 각각의 농도에서 얻어진 데이터들이 통계적으로 상이하지 않음을 보여주 었고 감도 또한 동일하였다 (Figure 10).
- DNA-광 결정 나노 구조화 어레이 플랫폼의 실현성이 실제 샘플인 PKD를 지닌 고양이의 혈액과 소변 샘플을 사용하여 테스트 되었다. 그 결과 한계 검출 농도는 0.005 ng/mL이었으며 이는 단일 어레이가 혈액과 소변 샘플에서 추출된 6 femtogram의 genomic DNA 검출할 수 있음을 보여주었다. 광 결정 나노 구조화 어레이를 통해 얻어진 감도는 DNA 분석을 위해 일반적으로 이용되고 그 성능이 입증된 real time-polymerase chain reaction (PCR)방법의 그것과 유사하였고 반면, 분석시간, 경제성, 현장 적용성등에서 오히려 향상된 DNA 분석 방법임을 입증하였다.
- 나노어레이의 스케일 장점으로 부터 오는 적은양의 샘플 (10 μL) 사용으로 확산에 의존하는 어래이 형태의 바이오센서의 측정속도를 향상시킬 수 있었고, 향상된 감도는 어레이 내부에 고정된 입자-면역복합체의 굴곡 (curvature)효과로 인해 항원/항체반응이 향상된 것과, 어레이 표면의 격자 (grating) 구조로부터 발생한 광 회절 (light diffraction)에서 기인한 형광 신호 증가로 설명될 수있다.
- 더불어 주어진 구조적 특징을 수치적 모델링에 적용 하여 분석한 결과 형광시그널을 발생시키기 위해 사용된 주어진 레이져의 파장 (excitation: 532 nm, emission: 555 nm)에서 40nm-650 nm의 경우 어레이의 각각의 웰 내부 주위에 일정 형태의 강화된 전기장이 형성되었고 (Figure 6), 이 전기장으로 인해 입자-면역복합체로부터의 형광 시그널이 증가되었다.
- 이 결과를 통해 마이크로 입자를 사용하는 것보다, 나노 입자를 그에 부합하는 사이즈의 어레이에 면역복합체의 기반으로 사용하는 것이 시그널의 향상에 크게 영향을 준다는 것을 알게 되었으며, 주어진 파장에 따라 광 결정 효과를 생성하고 면역복합체로 부터 발생하는 시그널을 더 향상시키기 위해 어레이의 구조를 최적화할 필요가 발견되었다. 또한 어레이의 웰 내부에서 국부적으로 강화된 전기장이 입자-면역복합체와 결합할 때 시그널이 증폭된다는 사실에서 개발된 전기 영동 입자 구속 시스템과 나노어레이의 결합이 광 결정 바이오센서의 개발에 결정적인 요인임을 보였다.
- 복잡한 고감도 시그널 변환기 또는 디텍터를 사용하지 않고 단순 이미지 분석만으로 얻어진 결과로써 바이오센서의 현장 분석 향상을 보였다. 나노어레이의 스케일 장점으로 부터 오는 적은양의 샘플 (10 μL) 사용으로 확산에 의존하는 어래이 형태의 바이오센서의 측정속도를 향상시킬 수 있었고, 향상된 감도는 어레이 내부에 고정된 입자-면역복합체의 굴곡 (curvature)효과로 인해 항원/항체반응이 향상된 것과, 어레이 표면의 격자 (grating) 구조로부터 발생한 광 회절 (light diffraction)에서 기인한 형광 신호 증가로 설명될 수있다.
- 이 특정 단백질은 암세포의 증식을 증폭시키는 역할을 하며 인체내에 유방암 세포가 발현되었을때 급격하게 그 양이 증가한다. 비록 HER2 단백질의 암세포 생성시 초기 발현 농도 경계점이 15 ng/mL[9]로 검출 한계농도가 극히 낮을 필요는 없으나 개발된 입자 결합 광 결정 나노 구조화 어레이의 실제 인체 질병 진단의 그 실효성과 감도 수준을 파악하는데 있어서 좋은 실례가 될수 있어서 HER2가 검출 대상물질로 선택되었다.
- 형광 시그널은 앞에서 언급한 바와 같이 고유한 광 결정 위상 정합에 의해 향상된다. 실험 결과, 전기 영동 고정화가 결합된 광 결정 나노 구조화 어레이에서 박테리오 파지를 검출한 감도가 기존의 형광 시그널 리더를 사용하여 얻어진것도 106배 향상되었음을 보여주었다 (Figure 13). 이러한 결과를 통해 전기 영동 시스템/광 결정 나노화 구조가 전하를 띈 파지를 직접적으로 고정시켜 정량 검출할 수 있게 함으로써 기존의 검출에 요구되었던 농축화 또는 배양등의 부가 과정등이 생략될 수 있고 신속하고 정확하며, 현장 사용이 가능한 병원체 검출이 가능하게 되었다.
- 실험 결과, 전기 영동 고정화가 결합된 광 결정 나노 구조화 어레이에서 박테리오 파지를 검출한 감도가 기존의 형광 시그널 리더를 사용하여 얻어진것도 106배 향상되었음을 보여주었다 (Figure 13). 이러한 결과를 통해 전기 영동 시스템/광 결정 나노화 구조가 전하를 띈 파지를 직접적으로 고정시켜 정량 검출할 수 있게 함으로써 기존의 검출에 요구되었던 농축화 또는 배양등의 부가 과정등이 생략될 수 있고 신속하고 정확하며, 현장 사용이 가능한 병원체 검출이 가능하게 되었다.
- 이를 통해 광 결정 나노 구조화 어레이에서 우유속의 다른 성분들에 의한 메트릭스 효과 (matrix effect)가 검출에 큰 영향을 미치지 못했음을 보여주었다. 적은 양의 샘플과 20분내의 면역 검출 시간, 그리고 단독 생체 분자 (single biomolecule)까지 검출할수 있는 감도로 개발된 분석 플랫폼의 범용성과 현장 적용성을 보여주 었다.
- 광결정 어레이 내부에서 나노 입자와 결합한 DNA 복합체가 여기와 발산의 위상 적합을 통해 복합체로부터 발생 하는 형광 시그널을 향상시킨다. 입자-DNA probe oligo가 전기 영동 입자 구속 시스템을 통해 광 결정 내부로 고정하고 샌드위치 hybridization과정을 통해 feline polycystic kidney disease를 유발하는 돌연변이의 1 base pair 차이를 확인할 수 있었다. 검출에 이용된 DNA oligo는 PKD의 SNP를 포함할수 있도록 합성된 것이었다.
- 이때 어레이 내부에 적용된 극성이 파지의 특정 방향으로의 지향-고정화를 조절할수 있는 주요 요소가 된다. 적용되는 전압의 정도가 높은 밀도의 균일배열을 형성하는데 가장 중요한 요소임을 보였다.
- 이를 통해 광 결정 나노 구조화 어레이에서 우유속의 다른 성분들에 의한 메트릭스 효과 (matrix effect)가 검출에 큰 영향을 미치지 못했음을 보여주었다. 적은 양의 샘플과 20분내의 면역 검출 시간, 그리고 단독 생체 분자 (single biomolecule)까지 검출할수 있는 감도로 개발된 분석 플랫폼의 범용성과 현장 적용성을 보여주 었다.
후속연구
- 병원체가 발생하는 초기 단계, 즉 농도가 극히 작고 샘플의 양도 한정되어 있는 그 시기에 현장 운용이 가능하고 고감도를 지닌 바이오센서가 개발된다면 앞서 언급된 기존 기술에서 오는 제한적 요소들이 해결될 수 있다. 더 나아가 자원, 자본 그리고 기술의 한계로 인해 의료지원조차 제대로 받지 못하는 나라들에게 경제적이면서 효과적인 바이오 센서의 개발은 전 세계의 모든 인류의 삶의 질을 균등히 발전시킬 수 있는 가능성을 제시한다. 지금까지 바이오 센서들은 공학, 광학, 물리학, 생물학, 화학등의 다양한 학제간 상호 연구를 통해 단기간에 많은 성과를 이루어 냈다.
- 이 결과를 통해 마이크로 입자를 사용하는 것보다, 나노 입자를 그에 부합하는 사이즈의 어레이에 면역복합체의 기반으로 사용하는 것이 시그널의 향상에 크게 영향을 준다는 것을 알게 되었으며, 주어진 파장에 따라 광 결정 효과를 생성하고 면역복합체로 부터 발생하는 시그널을 더 향상시키기 위해 어레이의 구조를 최적화할 필요가 발견되었다. 또한 어레이의 웰 내부에서 국부적으로 강화된 전기장이 입자-면역복합체와 결합할 때 시그널이 증폭된다는 사실에서 개발된 전기 영동 입자 구속 시스템과 나노어레이의 결합이 광 결정 바이오센서의 개발에 결정적인 요인임을 보였다.
- 그러나 세부농도 검출을 위한 더 나은 감도를 얻기 위해서는 포준 곡선에서 발견된 두개의 서로 다른 경사도의 로그-선형 검출 구간 문제가 해결되어야 한다. 특히 10-3-103pg/mL검출 구간의 낮은 경사도가 나노 입자 표면에 항원 고정시 passive 고정화 방법으로부터 기인한 항원량의 불규칙성으로부터 기인함(temkin isotherm)을 고려하였을때[10] 입자표면의 생체 분자물의 고정화 방법에 지속적인 연구가 필요함을 시사하였다.
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