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문제 정의
- 본 연구에서는, 고농도 질산성질소로 오염된 국내 지하수 중에서의 탈질산화작용에 의한 자연저감 가능성 및 저감율을 평가하고자 하였다. 이를 위하여, 우선적으로 탈질산화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성유전자(nirK, nirS, nosZ)를 분석하기 위한 기법을 확립한 후, 축산단지 주변 지하수 중에 고농도 질산성질소로 오염된 지역을 대상으로 지하수 중에 관련효소를 분석하여 자연 저감 가능성을 평가하였다.
- 본 연구에서는, 질산성질소로 오염된 국내지하수 중 탈질산화관련 효소를 구성하는 대표적인 기능성 유전자(functional gene)분석을 통해 탈질산화 가능성을 평가하고자 하였다. 이를 위해, 73.
가설 설정
- Fig. 6은 질산성질소가 완전 분해되어 아질산성질소로 전환된 후 질소가스로 완전 제거된다고 가정한 그래프이며, 초기 전체농도는 초기 아질산성질소 농도에 초기 질산성질소 농도를 더한 값으로 설정하였다. 두 지하수시료 모두에서 질산성질소가 감소하는 동안에는 아질산성질소가 증가하였으며, 질산성질소가 거의 분해되면 아질산성질소 역시 감소하는 양상이 나타났다.
제안 방법
- 형질전환된 clone을 선별한 후 T7 promotor primer나 SP6 promotor primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행하였다. DNA sequencing은 ABI 3100 자동염기서열 분석기를 이용하였다. 자세한 방법은 Maniatis방법(Kahng et al.
- Genomic DNA를 추출한 후 유전자 증폭기기(MyGenie TM 32 Thermal Block, Daejeon, Korea)를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 탈질산화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성유전자(nirK, nirS, nosZ)를 증폭하기 위해 사용한 primer의 염기서열, PCR산물의 증폭크기 및 PCR조건은 Table 2과 같다.
- 탈질산화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성유전자(nirK, nirS, nosZ)를 증폭하기 위해 사용한 primer의 염기서열, PCR산물의 증폭크기 및 PCR조건은 Table 2과 같다. PCR반응을 수행한 후, agarose gel 전기영동을 수행하였다. 최종 염기서열을 확인하기 위해, agarose gel로부터 회수된 PCR산물을 pGEM-T vector에 ligation 한 후 E.
- 질산성질소 저감율 시험을 위하여 162 mL 멸균병(Wheaton, Ringoes, NJ, USA)을 150℃에서 20분 동안 고압·멸균한 후 사용하였다. 고농도 질산성질소로 오염된 지하수시료 100 mL와 탄소원(fumarate)을 주입하여 반응조를 구성하였다. 대조군(Control)에 대한 질산성질소 자연저감율을 비교평가하기 위해, 일부 지하수 시료는 고온·고압(150℃, 2기압)에서 20분간 처리하였다.
- 대조군(Control)에 대한 질산성질소 자연저감율을 비교평가하기 위해, 일부 지하수 시료는 고온·고압(150℃, 2기압)에서 20분간 처리하였다.
- 이를 위하여, 우선적으로 탈질산화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성유전자(nirK, nirS, nosZ)를 분석하기 위한 기법을 확립한 후, 축산단지 주변 지하수 중에 고농도 질산성질소로 오염된 지역을 대상으로 지하수 중에 관련효소를 분석하여 자연 저감 가능성을 평가하였다. 또한, 탈질산화 관련 기능성 유전자가 존재하는 지하수를 대상으로 혐기성반응조를 제작한 후 질산성질소 자연저감율 및 탄소원 주입 후에 적극적 자연저감율을 비교분석하였다.
- , 2002)에 따라 수행하였다. 밝혀진 염기서열의 분석은 Laser gene program(DNA STAR, Inc., Madison, WI, USA)과 GenBank의 blast search의 database를 이용하였다.
- 현장수질측정값의 안정화 여부는 미국 지질조사소(USGS)의 자료를 기준으로 판단하였다(Table 1). 시료 채취 중 교란이나 기포가 발생하지 않도록 양수량을 조절하였으며, 대기 접촉으로 인한 시료의 변질을 방지하기 위해 채수병(무균 채수병 또는 멸균병) 상부의 빈 공간(headspace)이 발생하지 않도록 주의하여 시료를 채취하였다. 시료의 운반 및 보관은 냉장상태(0~4℃)를 유지하여 변질을 방지하였으며, 오염도가 높을 것으로 예상되는 시료는 별도로 분류하여 보관, 운반하였다.
- 시료 채취 중 교란이나 기포가 발생하지 않도록 양수량을 조절하였으며, 대기 접촉으로 인한 시료의 변질을 방지하기 위해 채수병(무균 채수병 또는 멸균병) 상부의 빈 공간(headspace)이 발생하지 않도록 주의하여 시료를 채취하였다. 시료의 운반 및 보관은 냉장상태(0~4℃)를 유지하여 변질을 방지하였으며, 오염도가 높을 것으로 예상되는 시료는 별도로 분류하여 보관, 운반하였다.
- 2% Triton X-100, 20 mg/mL lysozyme)에 균을 부유한 후 37℃에서 30분간 반응, Proteinase K를 넣고 70℃에서 30분간 반응 과정을 순차적으로 진행하였다. 에탄올 첨가 후 컬럼을 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 DNA는 Nanodrop ND-1000 분광광도계(Nanodrop Technologies, Rockland, USA)를 이용하여 DNA농도와 순수도(260/280 ratio)를 확인하였다.
- 음이온(NO3, NO2)은 이온크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 이온크로마토그래피 측정용 시료는 매일 10 mL 씩 채취하여 0.
- 본 연구에서는, 고농도 질산성질소로 오염된 국내 지하수 중에서의 탈질산화작용에 의한 자연저감 가능성 및 저감율을 평가하고자 하였다. 이를 위하여, 우선적으로 탈질산화 반응에 관여하는 효소를 구성하고 있는 기능성유전자(nirK, nirS, nosZ)를 분석하기 위한 기법을 확립한 후, 축산단지 주변 지하수 중에 고농도 질산성질소로 오염된 지역을 대상으로 지하수 중에 관련효소를 분석하여 자연 저감 가능성을 평가하였다. 또한, 탈질산화 관련 기능성 유전자가 존재하는 지하수를 대상으로 혐기성반응조를 제작한 후 질산성질소 자연저감율 및 탄소원 주입 후에 적극적 자연저감율을 비교분석하였다.
- 본 연구에서는, 질산성질소로 오염된 국내지하수 중 탈질산화관련 효소를 구성하는 대표적인 기능성 유전자(functional gene)분석을 통해 탈질산화 가능성을 평가하고자 하였다. 이를 위해, 73.9~293.2 mg/L 농도의 질산성질소로 오염된 지하수 3개 시료에서 추출된 genomic DNA에서 nirK, nirS 및 nosZ를 증폭할 수 있는 primer(Table 2)를 이용하여 PCR을 한 후 전기영동으로 최종 산물을 확인하였다. 그 결과, nitrate reductase(NO3→NO2)를 구성하는 nirK(160 bp)는 Fig.
- 이온크로마토그래피 측정용 시료는 매일 10 mL 씩 채취하여 0.45 µm PES membrane 필터로 걸러낸 후, CH/850 Professional IC(Metrohm, Herisau, Swizerland)를 이용하여 분석하였다.
- 에탄올 첨가 후 컬럼을 이용하여 DNA를 정제하였다. 정제한 DNA는 Nanodrop ND-1000 분광광도계(Nanodrop Technologies, Rockland, USA)를 이용하여 DNA농도와 순수도(260/280 ratio)를 확인하였다.
- 5배)를 탄소원으로 주입하였다. 제작된 반응조에서 질산성질소 및 아질산성질소 변화를 모니터링하여 질산성질소 분해율과 중간생성물인 아질산성질소 생성율 및 분해율을 평가하였다. Fig.
- 지하수 시료는 채취 전 현장수질측정 항목(EC, pH 등)의 측정값이 안정될 때까지 지하수를 퍼징하였다. 현장수질측정값의 안정화 여부는 미국 지질조사소(USGS)의 자료를 기준으로 판단하였다(Table 1).
- 지하수 중 질산성질소 농도 현황 파악을 위해 농·축산지역 주변 지하수 관정약 2,500개를 분기별(총 8,000개 관정)로 조사하여, 질산성질소의 경시적 변화를 모니터링 하였다(Fig. 2).
- PCR반응을 수행한 후, agarose gel 전기영동을 수행하였다. 최종 염기서열을 확인하기 위해, agarose gel로부터 회수된 PCR산물을 pGEM-T vector에 ligation 한 후 E. coli JM109에 형질전환 하였다. 형질전환된 clone을 선별한 후 T7 promotor primer나 SP6 promotor primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행하였다.
- 탄소원 농도에 따른 질산성질소 저감율을 도출하기 위해 fumarate 0.92 M fumarate/1 M NO3-N(화학량론적 필요량의 2.0배)과 1.08 M fumarate/1 M NO3-N(화학량론적 필요량의 2.6배)를 적용하였고, 시료는 탈질산화 효소(nirK, nirS, nosZ) 분석을 통해 분해효소가 존재하는 지하수를 선정하여 질산성질소 저감시험을 진행하였다. 대조군 지하수와 fumarate 0.
- 탄소원으로 주입된 fumarate분석을 위하여, 0.45 µm PES membrane filter로 여과한 지하수시료 중 20 µL를 UV/VIS detector가 장착된 Simadzu HPLC system(LC-30AC pump, SIL-30AC autosampler)를 사용하여 분석하였다.
- coli JM109에 형질전환 하였다. 형질전환된 clone을 선별한 후 T7 promotor primer나 SP6 promotor primer를 이용하여 DNA sequencing을 수행하였다. DNA sequencing은 ABI 3100 자동염기서열 분석기를 이용하였다.
대상 데이터
- 고농도 질산성질소(300~600 mg NO3/L)로 오염된 지역의 두 개의 지하수관정으로부터 시료를 채취하여, 혐기성 반응조를 제작하였다. 이때 실험에 사용된 지하수의 화학적 특성은 Table 3에 나타낸바와 같다.
- 01 mM NO3/day의 분해효율을 각각 도출할 수 있었다(Kim and Kim, 2006). 본 연구에서는, 효율이 가장 높은 것으로 확인된 fumarate를 지하수 중 질산성질소 제거를 위한 탄소원으로 선정하였다.
- 분석용 컬럼은 High performance LC-GMBH (Repro-Gel H+, 9 µm, 250 mm*8 mm)이었으며, 이동상은 9 mM H2SO4를 사용하였다.
- 45 µm PES membrane 필터로 걸러낸 후, CH/850 Professional IC(Metrohm, Herisau, Swizerland)를 이용하여 분석하였다. 이때, 컬럼은 Metrosep C4, 150/4.0(Metrohm, Herisau, Swizerland)과 Metrosep A supp 5, 150/4.0(Metrohm)을 사용하였으며, 이동상은 0.1 mM H2SO4을 사용하였다.
이론/모형
- DNA sequencing은 ABI 3100 자동염기서열 분석기를 이용하였다. 자세한 방법은 Maniatis방법(Kahng et al., 2002)에 따라 수행하였다. 밝혀진 염기서열의 분석은 Laser gene program(DNA STAR, Inc.
- 지하수 시료는 채취 전 현장수질측정 항목(EC, pH 등)의 측정값이 안정될 때까지 지하수를 퍼징하였다. 현장수질측정값의 안정화 여부는 미국 지질조사소(USGS)의 자료를 기준으로 판단하였다(Table 1). 시료 채취 중 교란이나 기포가 발생하지 않도록 양수량을 조절하였으며, 대기 접촉으로 인한 시료의 변질을 방지하기 위해 채수병(무균 채수병 또는 멸균병) 상부의 빈 공간(headspace)이 발생하지 않도록 주의하여 시료를 채취하였다.
성능/효과
- 1. 농·축산단지 주변 지하수 중 질산성질소 농도는 월별 혹은 계절별 큰 변화 없이 평균 8.2~9.1 mg/L가 검출되었다.
- 2. 고농도 질산성질소 오염지역을 대상으로 질산성질소 자연저감과 관련된 효소(Nitrate reductase, nitrite reductase (nirS, nirK), nitric oxide reductase, nitrous oxide reductase (nosZ) 등)을 구성하는 단계별 유전자를 분석한 결과, nitrate reductase(NO3→NO2)와 nitrous oxide reductase(NO2→N2)이 존재함을 확인할 수 있었다.
- 3. nirK 및 nosZ 유전자가 모니터링된 지하수를 대상으로 질산성질소 탈질산화를 시험한 결과, 탄소원(fumarate)의 존재할 때 분해율을 확인할 수 있었다. 이는, 현장에서 질산성질소 저감 효율을 높이기 위해 탄소원 공급이 필요함을 나타낸다.
- 4. 질산성질소 저감효율이 가장 좋은 fumarate를 탄소원으로 선정하였으며, 화학량론적 필요량의 1.5배(0.63 M) fumarate를 지하수 시료에 주입한 결과 300~600 mg NO3/L가 20 mg/L/day의 속도로 각각 26일, 10일 안에 분해되었다.
- 그 결과, nitrate reductase(NO3→NO2)를 구성하는 nirK(160 bp)는 Fig. 8(L)에서 보이는 것과 같이 293.2 mg/L 질산성질소로 오염된 지하수시료에서 확인되었고, nitrous oxide reductase(NO2→N2)를 구성하는 nosZ(259 bp)는 3개 지하수시료 모두에서 확인되었다.
- 45 mg/L/day였다. 대조군 반응조(0.92 M 탄소원 주입)와 0.92 M 탄소원을 주입한 반응조는 유사하게 낮은 초기분해율을 나타냈으나, 14일을 기점으로 열처리되지 않은 반응조는 탄소원 분해가 높게 나타났다. 열처리에 의해 영향을 받은 탈질산화 미생물은 탄소원 분해 및 탈질산화반응에서 저해를 보였지만, 완전히 활성을 잃지 않은 것을 확인할 수 있었다.
- 6배)를 적용하였고, 시료는 탈질산화 효소(nirK, nirS, nosZ) 분석을 통해 분해효소가 존재하는 지하수를 선정하여 질산성질소 저감시험을 진행하였다. 대조군 지하수와 fumarate 0.92 M fumarate/1 M NO3-N(화학량론적 필요량의 2.0배)을 주입한 각각의 반응조에서는 지하수 중 질산성질소 초기 농도값(114~120 mg/L)이 15일 이후 10.7%, 14.7% 감소하였다. 10일 이상 지속되는 반응기간 동안 질산성질소 농도는 추가적인 분해 없이 일정하게 유지되었다.
- 6은 질산성질소가 완전 분해되어 아질산성질소로 전환된 후 질소가스로 완전 제거된다고 가정한 그래프이며, 초기 전체농도는 초기 아질산성질소 농도에 초기 질산성질소 농도를 더한 값으로 설정하였다. 두 지하수시료 모두에서 질산성질소가 감소하는 동안에는 아질산성질소가 증가하였으며, 질산성질소가 거의 분해되면 아질산성질소 역시 감소하는 양상이 나타났다. 질산성질소 분해율은 두 시료 모두 초기농도와 관계없이 동일한 비율의 fumarate를 주입하였을 때 20 mg/L/day로 유사하였으며, 단지 완전분해까지 걸리는 시간만 상이하였다.
- 특히 실험기간 동안 중간생성물인 아질산성질소를 모니터링한 결과, 600 mg NO3/L 시료에서 아질산성질소는 질산성질소가 분해되는 동안 꾸준히 축적되었다가, 질산성질소 분해율이 감소하는 시기를 기점으로 아질산성질소가 저감되기 시작하여 44일 정도에는 90% 이상 분해된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 300 mg NO3/L 시료는 아질산성질소 축적 없이 10일안에 100% 분해된 것을 확인할 수 있었다. 앞에서 진행된 회분식반응조 결과와 비교하여, 현장지하수는 25배 이상 높은 질산성질소 분해율이 확인되었다.
- 이는, 상대적으로 적은 화학량적인 탄소원을 주입할지라도, 지하수 관정의 질산성질소 오염 정도(농도 및 기간) 및 탈질산화 분해 미생물의 활성도 등에 따라 질산성질소 분해기간 및 분해율은 상이한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 고농도로 오염된 지하수는 탈질산화미생물 활성도가 매우 높기 때문에, 지하수 중에 300~600 mg NO3/L는 충분히 자연미생물에 의한 탈질산화를 통해 중간생성물인 아질산성질소의 축적 없이 제거될 수 있음을 최종 확인하였다.
- 축사 밀집지역에서 나타나는 토양오염과 지하수 수질특성을 해석하기 위해 제주도의 한림지역에서의 수행된 연구를 살펴보면(Hyeon, 2011), 지하수에 영향을 미칠 수 있는 질소부하량은 축산계에서 258 ton-N/yr로 지하수 오염원은 가축분뇨에서 가장 많이 기인하는 것으로 예측되었다. 또한, 심도별 지하수의 수리지구화학적 특성은 SO4, NO3-N 농도가 천부지하수로 갈수록 높게 나타나 지표의 영향을 받는 것으로 추정되었다. 음용수에서 고농도의 질산성질소는 청색증, 암유발 등 인간 건강에 매우 위협적이다(Ginocchio, 1984).
- 즉, fumarate는 질산성질소를 분해하는데 수소공급원으로 작용할 뿐만 아니라 아질산성질소를 분해하는데도 수소공급원으로 원활히 사용된 것으로 보인다. 또한, 아질산성질소와 fumarate가 저감 완료되는 시기가 일치하는 것으로 보아, 적용된 탄소원 비율(0.63 M fumarate/1 M NO3-N)이 적절했다고 판단된다.
- 10일 이상 지속되는 반응기간 동안 질산성질소 농도는 추가적인 분해 없이 일정하게 유지되었다. 반면에, 1.08 M fumarate/1 M NO3-N를 주입한 반응조에서 초기 질산성질소 농도는 9일 이후 분해하기 시작하였으며, 26일 동안 지속적으로 감소되어 평균 1.13 mg/L/day의 분해율을 보였다(Fig. 3). 이러한 현상은, 동일한 지하수시료에 탄소원 농도를 높여 주었을 때 질산성질소 제거효율이 향상될 수 있음을 나타낸다.
- 08 M/1 M NO3-N fumarate를 주입한 반응조는 fumarate의 농도가 하루 안에 급속히 감소하였으며, 26일 동안 지속적으로 탄소원을 분해하며 전자공여체로서 수소를 공급한 것으로 보인다. 본 실험에서는, 모든 반응조에서 초기 질산성질소가 100% 분해되지 않았는데, 이는 사용된 현장 지하수의 탈질산화 분해 효소활성이 비교적 낮은 것으로 사료되며, 탈질산화 분해 효소 활성이 질산성 질소 분해율에 영향을 미칠 것으로 예상 할 수 있었다.
- 효소 분석을 통해 nirK와 nosZ 유전자가 존재하는 지하수 시료를 바탕으로 회분식반응조 실험을 한 결과 앞에서 살펴보았듯이 질산성질소 저감율을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 국내 지하수 중에 탈질산화의 각 단계별 반응과 관련된 효소를 구성하고 있는 유전자가 있음을 확인할 수 있었고, 또한 이러한 유전자분석법을 통하여 실내실험 혹은 현장실험 이전에 질산성질소 자연저감 가능성을 평가할 수 있음을 확인하였다.
- 또한, 300 mg NO3/L 시료는 아질산성질소 축적 없이 10일안에 100% 분해된 것을 확인할 수 있었다. 앞에서 진행된 회분식반응조 결과와 비교하여, 현장지하수는 25배 이상 높은 질산성질소 분해율이 확인되었다. 이는, 상대적으로 적은 화학량적인 탄소원을 주입할지라도, 지하수 관정의 질산성질소 오염 정도(농도 및 기간) 및 탈질산화 분해 미생물의 활성도 등에 따라 질산성질소 분해기간 및 분해율은 상이한 것을 확인할 수 있었다.
- 92 M 탄소원을 주입한 반응조는 유사하게 낮은 초기분해율을 나타냈으나, 14일을 기점으로 열처리되지 않은 반응조는 탄소원 분해가 높게 나타났다. 열처리에 의해 영향을 받은 탈질산화 미생물은 탄소원 분해 및 탈질산화반응에서 저해를 보였지만, 완전히 활성을 잃지 않은 것을 확인할 수 있었다. 1.
- 2 mg/L 질산성질소로 오염된 지하수시료에서 확인되었고, nitrous oxide reductase(NO2→N2)를 구성하는 nosZ(259 bp)는 3개 지하수시료 모두에서 확인되었다. 전기영동으로 확인된 밴드는 재추출한 후 염기서열분석을 통해서 최종적으로 nirK와 nosZ임을 확인할 수 있었다(Table 4). 추가적으로 15개 시료에서 nosZ를 분석한 결과 모든 지하수시료에서 모니터링되었다(Fig.
- 두 지하수시료 모두에서 질산성질소가 감소하는 동안에는 아질산성질소가 증가하였으며, 질산성질소가 거의 분해되면 아질산성질소 역시 감소하는 양상이 나타났다. 질산성질소 분해율은 두 시료 모두 초기농도와 관계없이 동일한 비율의 fumarate를 주입하였을 때 20 mg/L/day로 유사하였으며, 단지 완전분해까지 걸리는 시간만 상이하였다. 분해율 증가를 통한 분해시간 단축은 탄소원 증가 또는 현장 환경(토착탈질산화미생물 분포 등)에 따라 다를 것으로 판단된다.
- 8 mg/L/day로 급격히 분해되어 10일안에 100%분해되었다. 특히 실험기간 동안 중간생성물인 아질산성질소를 모니터링한 결과, 600 mg NO3/L 시료에서 아질산성질소는 질산성질소가 분해되는 동안 꾸준히 축적되었다가, 질산성질소 분해율이 감소하는 시기를 기점으로 아질산성질소가 저감되기 시작하여 44일 정도에는 90% 이상 분해된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 300 mg NO3/L 시료는 아질산성질소 축적 없이 10일안에 100% 분해된 것을 확인할 수 있었다.
- 혐기성 반응조에서 fumarate 분해율을 모니터링한 결과(Fig. 4), 열처리된 대조군 반응조(fumarate 0.92 M fumarate/1 M NO3-N주입)와 0.92 M/1 M NO3-N 및 1.08 M/1 M NO3-N fumarate가 주입된 반응조에서 fumarate 평균 분해율은 각각 1.41, 2.36, 4.45 mg/L/day였다. 대조군 반응조(0.
- 9). 효소 분석을 통해 nirK와 nosZ 유전자가 존재하는 지하수 시료를 바탕으로 회분식반응조 실험을 한 결과 앞에서 살펴보았듯이 질산성질소 저감율을 확인할 수 있었다. 본 연구결과는 국내 지하수 중에 탈질산화의 각 단계별 반응과 관련된 효소를 구성하고 있는 유전자가 있음을 확인할 수 있었고, 또한 이러한 유전자분석법을 통하여 실내실험 혹은 현장실험 이전에 질산성질소 자연저감 가능성을 평가할 수 있음을 확인하였다.
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