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문제 정의
- 본 연구에서는 조명나방 생물적 방제에 중요한 Trichogramma속 알기생벌의 국내 옥수수 포장 내 발생 정보를 얻기 위해 2011~2013년 여러 포장에서 수집한 Trichogramma속 조명나방 알기생벌들의 ITS2 DNA 염기서열 전체영역을 해독하고 NCBI GenBank 데이터베이스에 등록되어 있는 Trichogramma 종들의 ITS2 DNA 염기서열과 비교분석하여 옥수수 포장에서 실제 자연발생 하는 종을 추정하고자 하였다.
제안 방법
- PCR 증폭 결과를 확인하기 위해서 1% 아가로스겔과 1×TAE 버퍼에서 100 V로 25분간 전기영동을 하였다.
- 게놈 DNA 추출을 위해 알기생벌 성충 1 마리를 20 mM NaOH 용액180 μl와 함께 1.5 ml 튜브에 넣고 마쇄한 후95℃에서 10분간 가열하였다.
- 증폭된 산물은 1% 아가로스겔로부터 IncloneTM Gel & PCR purification kit(Inclonebiotech CO, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따 순수하게 회수되었다. 분리된 PCR산물은 다시 PCR-direct sequencing을 위해 (주)마크로젠(Korea)에 보존형 프라이머인 ITS3와 ITS4를 이용하여 각각 양방향으로 염기서열 분석을 의뢰하였으며 이를 통해 해독한 알기생벌지역별 개체의 ITS2 핵내 리보솜 DNA 염기서열 정보를 Gene Runner ver. 3.05 (Hastings Software, Inc., 1994) 프로그램을 이용하여 정리하였다.
- 염기서열 차이 추정값(d: estimate of evolutionary distances from nucleotide sequences) (Nei and Kumar, 2000)은 Kimura 2-parameter model (K2P), Uniform rates, Pairwise deletion, Bootstrap method (1,000 반복)으로 설정하여 종 내 또는 그룹 내 차이(within distance)와 종 간 또는 그룹 간 차이(between distance) 값을 분석하였다. 분자계통분석을 위해서 Neighborjoining method, K2P, Uniform rates, Pairwise deletion, Bootstrap method (1,500 반복)으로 설정하여 추정된 계통수를 얻었으며 다시 Bootstrap 값을 50%로 cut-off한 계통수(Bootstrap consensus tree)를 만들었다. 계통수는 FigTree Ver.
- 한편, NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)의 BLASTN 프로그램을 이용하여 본 연구에서 해독된 각 그룹의 ITS2 DNA 염기서열들과 가장 유사한 염기서열을 찾아 종을 동정하는데 참고하였다.
대상 데이터
- GenBank 데이터베이스에서 얻은 정보들(384개)과 본 연구에서 해독한 정보(112개)들로부터 리보솜 RNA 부분의 염기서열을 제거한 순수한 ITS2 DNA 염기서열을 얻기 위해서 The ITS2 Database (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)의 Annotate 기능을 이용하였다.
- 5 ml 튜브에 옮기고 ITS2 영역 증폭을 위한 PCR 반응에 사용하였으며 남은 추출물은 –20℃ 냉동보관을 하였다. Table 1의 부안과 홍천을 제외한 지역들은 각각 10마리 씩 추출을 하였으며 부안은 1마리, 홍천은 포장 당 30마리(10마리/알 덩어리, 3반복) 씩 6포장의 총 170마리(한 포장만 20마리)로부터 게놈DNA를 추출하였다.
- 분자계통분석을 위해서 Neighborjoining method, K2P, Uniform rates, Pairwise deletion, Bootstrap method (1,500 반복)으로 설정하여 추정된 계통수를 얻었으며 다시 Bootstrap 값을 50%로 cut-off한 계통수(Bootstrap consensus tree)를 만들었다. 계통수는 FigTree Ver. 1.4.0 (http://tree.bio.ed.ac.uk/) 프로그램을 이용하여 최종 편집을 하였다.
- 조명나방의 알기생벌 수집을 위해 국립식량과학원(수원)에서 반합성 인공사료(Jung et al., 2005)를 이용하여 실내사육 조건(25℃, RH 60%, 광주기 15L/9D)에서 누대사육 중인 조명나방으로부터 유산지에 산란된 알 덩어리를 이용하였다. 한 개의 알 덩어리가 포함되도록 유산지를 사각형(약 2 × 2 cm)으로 잘라내고 조명나방 성충이 발생하는 6월과 7월 사이 경기 수원, 전북 부안, 고창, 익산, 충북 청원, 경북 칠곡, 강원 평창, 홍천지역의 찰옥수수 재배 포장 내 옥수수 잎 뒷면에 사무용 침핀(∅1.
- 한 개의 알 덩어리가 포함되도록 유산지를 사각형(약 2 × 2 cm)으로 잘라내고 조명나방 성충이 발생하는 6월과 7월 사이 경기 수원, 전북 부안, 고창, 익산, 충북 청원, 경북 칠곡, 강원 평창, 홍천지역의 찰옥수수 재배 포장 내 옥수수 잎 뒷면에 사무용 침핀(∅1.6 × 28 mm)을 이용하여 옥수수 1주당 1 ~ 5개의 알 덩어리를 설치하였다(Table 1).
- 와 Trichogrammatoidea spp. 핵내 리보솜 DNA 염기서열 정보를 62종 382개를 얻었다(Table 2 and Fig. 1). 그리고 염기서열 차이(evolutionary distance)와 분자계통분석(phylogenetic analysis)을 위해 Trichogramma spp.
데이터처리
- 각 알고리즘들의 alignment 결과들을 비교하였을 때 Kalign 알고리즘이 Trichogramma속 ITS2 영역의 시작 염기서열인 5′-TTTATAAAAAC-3′를 가장 잘 정렬하여 Kalign 알고리즘으로 alignment한 결과를 이용하여 MEGA5 프로그램에서 염기서열 차이 분석과 분자계통분석을 실시하였다.
이론/모형
- Phylogenetic tree analysis of the ITS2 sequence of 112 Trichogramma egg parasitoids collected in Korean corn fields, and 62 species of Trichogramma and Trichogrammatoidea (total 382) retrieved from the NCBI GenBank database. Consensus trees were inferred using the neighbor-joining method with the K2P substitution model (bootstrap method: 1,500 replicates, pairwise deletion) and reconstructed by 50% cut-off of bootstrap values. Bootstrap values are expressed as percentages.
- 확보한 전체 496개의 ITS2 DNA 염기서열들을 비교 분석하기 위해서 multiple sequence alignment를 Kalign (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/)과 MAFFT (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/) 그리고 MEGA5 (Tamura et al., 2011)에 내장된 ClustalW 알고리즘을 사용하였다. 이때 gap penalty 등 분석 파라미터들은 각 프로그램에 기본설정된 조건을 활용하였다.
성능/효과
- GenBank 데이터베이스 등록 Trichogramma속과 국내 수집 조명나방 알기생벌들의 ITS2 전체영역을 Kimura 2-parameter model (K2P)을 이용하여 종/그룹 내 또는 종/그룹 간 염기서열 차이(d)를 분석한 결과(Table 4), 종 내 비교 시 d 값은 0.000 ~0.086이었으나 국내 수집 조명나방 알기생벌 그룹 내 d 값은 0.005 이하로 매우 낮았으며, 그룹/종 간 비교에서 outgroup인 U. semifumipennis와 N. vitripennis와는 세 그룹 모두0.4 이상의 차이를 보였다. 그리고 그룹 간 비교에서도 0.
- GenBank에 등록된 reference 종들의 ITS2 전체 길이와 염기서열 정보를 비교한 결과(Table 2), 종 내, 종 간 길이 변이가 다양하게 나타났으며, 종 내에도 3′말단의 특이적 패턴 변이가 있거나 같은 패턴을 종 간 공유하고 있는 것을 알 수 있었다.
- K-3는 T. confusum, 명충알벌(T. chilonis Ishii), T. bilingensis 모두 3 종과 함께 분지되었는데(bootstrap value: 99.0%), T. confusum은 중국, 대만, 태국, 러시아, 이란, 인도에서, T. chilonis는 파키스탄, 중국에서, 그리고 T. bilingensis는 중국에서 채집된 집단이었다. T.
- 1와 같은 그룹으로 분지되었다. NCBI BLAST 결과에서도 K-3 그룹 내의 홍천 지역 채집 알기생벌은 중국, 대만, 태국의 T. confusum과 99-100% identity를 보였다(Table 5). 이상의 결과로부터 K-3 그룹 내 홍천지역에서 채집된 알기생벌들은 Honda et al.
- , 2006). NCBI BLAST 결과에서도 일본, 중국, 남미의 T. dendrolimi 정보와 99% identity를 보였다(Table 5). T.
- 국내에서 채집된 Trichogramma속 조명나방 알기생벌 112개체들의 ITS2 전체영역과 GenBank 데이터베이스의 64종 384 개의 ITS2 전체영역 정보를 이용하여 Neighbor-joining 방법을 통해 분자 계통수를 추정한 결과 국내의 3 그룹(K-1, K-2, K-3) 모두 각각 다른 계통으로 분지되었다(Fig. 1).
- 그리고 국내 6개 지역에서 수집된 조명나방 알기생벌 112 개체의 ITS2 영역의 전체염기서열 길이와 3′말단 염기서열 정보를 분석한 결과 3개의 그룹으로 나눌 수 있었다(Table 3).
- 보존형 PCR 프라이머인 ITS3와 ITS4(White et al., 1990)를 이용하여 국내에서 채집된 조명나방 알기생벌 개체들의 게놈 DNA로부터 PCR 반응 결과 약 600 ~ 700 bp 사이의 단일 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 단일 증폭산물을 이용하여 PCR-direct sequencing을 수행하였으나 ITS2 영역의 (CA)n 또는 (TGC)n 등의 반복 염기서열이 나오는 부분에서 sequencing 에러가 자주 발생하여 전체 염기서열을 해독하는데 어려움이 있었다.
- ostriniae를 국내 야외 포장에서 채집된 기록이 없었다. 본 연구에서는 6개 조사지역(홍천, 수원, 청원, 익산, 부안, 고창) (Table 3)에서 채집된 조명나방 알기생벌들의 K-1 그룹이 NCBI BLAST 결과에서 중국(AY244463.1) 또는 일본(AY518695.1)의 정보와 99% identity를 보였다(Table 5). 염기서열 차이(d) (Table 4)와 계통분석(Fig.
- 1)의 정보와 99% identity를 보였다(Table 5). 염기서열 차이(d) (Table 4)와 계통분석(Fig. 1), 그리고 NCBI BLAST 결과로부터 옥수수 포장에서 채집된 K-1 그룹은 T. ostriniae로 추정되었다. 앞으로 K-1 그룹에 대한 명확한 종 동정을 위해서는 ITS2 염기서열 분석 결과를 바탕으로 형태적 형질들을 비교 분석하는 등 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
- confusum과 99-100% identity를 보였다(Table 5). 이상의 결과로부터 K-3 그룹 내 홍천지역에서 채집된 알기생벌들은 Honda et al. (2006)의 T. chilonis Ishii보다는 Li et al.(2004)이 제안한 T.
- 전북 부안을 제외한 모든 조사지역들에서 옥수수 잎 뒷면에 설치된 알 덩어리의 주당 알 기생률이 20% 이상이었다(Table 1). 유전자원 수집 지역 중 개활지 포장은 부안, 칠곡, 청원, 고창, 익산, 수원이었으며 산간지 포장은 평창과 홍천이었다.
- confusum과 가장 가깝게 추정되었다. 한편, 고창지역에서 채집된 K-3 그룹의 알기생벌은 NCBI BLAST 결과 T. bilingensis (He and Pang, 2000) (AY244459.1), T. confusum과 각각 98% identity를 보였으나 두 종 간 ITS2 염기서열 차이(d) (Data not shown)가 작아종 추정이 어려웠다. T.
- 전북 부안의 옥수수 포장은 새만금간척지 내에 위치한 국립식량과학원 벼맥류부 시험연구포장으로 조사 시기 알기생벌에 의한 기생은 주당 4%로 낮았다. 홍천지역의 경우 산 아래 포장들로 주변에 찰옥수수가 많이 재배되고 있었는데 총 905 마리의 알기생벌 유전자원이 수집되었으며 그중에 암컷이 553 마리, 수컷이 139 마리로 전체적인 암:수 성비가 약 4:1로 암컷에 편중되었다. Jung et al.
후속연구
- confusum과 각각 98% identity를 보였으나 두 종 간 ITS2 염기서열 차이(d) (Data not shown)가 작아종 추정이 어려웠다. T. confusum Viggiani와 T. chilonis Ishii 그리고 T. bilingensis He and Pang, 3 종에 대한 분류학적 결론을 내리기 위해 앞으로 수컷 생식기에 대한 외부 형태적 형질뿐만 아니라 미토콘드리아와 핵 등 다른 영역의 염기서열 분석이 병행되어야 할 것으로 보인다.
- 그동안 국내에서는 Trichogramma속 알 기생 천적에 대한 연구가 많이 없었는데 분자생물학적 분석기술의 발달과 해외 전문 연구 그룹의 노력으로 NCBI GenBank 데이터베이스에 주요 Trichogramma속에 대한 ITS2 DNA 염기서열 정보가 60여 종 등록되어 있어 본 연구 결과에서처럼 참고정보와 비교 분석을 통해 종 추정이 가능하게 되었다. 그러나 종 동정을 확정하기 위해서는 수컷 외부 생식기 등 형태적 형질과 생식적 격리와 같은 생물적 특성에 대한 연구가 병행되어야 할 것으로 사료된다.
- dendrolimi 임을 제안하였다. 본 연구에서는 경남지방보다 높은 위도에 위치한 홍천지역(Table 1, Table 3)의 옥수수 포장에서 T. dendrolimi로 추정되는 표본을 얻을 수 있었으며 이것 또한 명확한 종 동정을 위해 수컷 생식기의 형태적 형질 등을 비교 분석하는 추가 연구가 필요하다.
- ostriniae로 추정되었다. 앞으로 K-1 그룹에 대한 명확한 종 동정을 위해서는 ITS2 염기서열 분석 결과를 바탕으로 형태적 형질들을 비교 분석하는 등 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 앞으로 국내 Trichogramma속 토착 천적을 활용하기 위해서 지역별, 숙주별, 식물별 발생하는 알기생벌의 종류와 분포 조사가 필요하며 대량분석을 위해 ITS2 DNA 염기서열 정보 확보는 그 시발점이 될 것으로 기대된다.
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