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문제 정의
- 본 연구에서는 높은 pH와 온도 안정성을 갖는 것으로 보고 된 키토산 비드에 셀룰라아제 효소를 고정화하여 셀룰로오스로부터 포도당을 생산하고자 하였다. Maleic anhydride로 변형시킨 폴리비닐알콜을 키토산 비드에 코팅하는 방법 [11]으로 고정화 지지체를 만든 후 셀룰라아제 효소를 고정화 시켰을 때, 셀룰라아제 효소 용액의 농도에 따른 효소의 고정화량과, 각 농도에서 고정화된 효소의 비활성도에 대해 조사하였다.
- 본 연구에서는 높은 pH와 온도 안정성을 갖는 것으로 보고 된 키토산 비드에 셀룰라아제 효소를 고정화하여 셀룰로오스로부터 포도당을 생산하고자 하였다. Maleic anhydride로 변형시킨 폴리비닐알콜을 키토산 비드에 코팅하는 방법 [11]으로 고정화 지지체를 만든 후 셀룰라아제 효소를 고정화 시켰을 때, 셀룰라아제 효소 용액의 농도에 따른 효소의 고정화량과, 각 농도에서 고정화된 효소의 비활성도에 대해 조사하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 높은 pH와 온도 안정성을 갖는 것으로 보고 된 키토산 비드에 셀룰라아제 효소를 고정화하여 셀룰로오스로부터 포도당을 생산하고자 하였다. Maleic anhydride로 변형시킨 폴리비닐알콜을 키토산 비드에 코팅하는 방법 [11]으로 고정화 지지체를 만든 후 셀룰라아제 효소를 고정화 시켰을 때, 셀룰라아제 효소 용액의 농도에 따른 효소의 고정화량과, 각 농도에서 고정화된 효소의 비활성도에 대해 조사하였다. 또한 최대 셀룰라아제 비활성도를 나타낸 조건에서 셀룰로오스로부터 포도당으로의 전환을 수행하였다.
- Maleic anhydride로 변형시킨 폴리비닐알콜을 키토산 비드에 코팅하는 방법 [11]으로 고정화 지지체를 만든 후 셀룰라아제 효소를 고정화 시켰을 때, 셀룰라아제 효소 용액의 농도에 따른 효소의 고정화량과, 각 농도에서 고정화된 효소의 비활성도에 대해 조사하였다. 또한 최대 셀룰라아제 비활성도를 나타낸 조건에서 셀룰로오스로부터 포도당으로의 전환을 수행하였다.
- Maleic anhydride를 이용한 PVA의 변형을 위해 12 g의 PVA를 120 mL의 증류수에 용해시켜 PVA 용액을 만들었다. PVA 용액이 든 비커에 magnetic bar를 넣고, pH 전극을 장치한 후 ice bath에서 온도를 4℃로 유지하였다.
- 20% (w/v) 셀룰라아제 효소 용액을 증류수로 희석하여 10 mL의 농도가 각각 1, 2, 4, 8, 10, 20% (w/v)가 되도록 준비한 후, 각각의 샘플 (0.1 mL)을 채취하였다. 각각의 효소 용액에 변형된 PVA가 코팅된 가교 키토산 비드를 5 g씩 넣어 4℃ orbital shaker에서 150 rpm으로 3시간 동안 shaking하여 고정화시킨 후, sieve로 효소가 고정화된 비드를 여과하여 분리하였다.
- 1 mL)을 각각의 농도별로 채취하였다. 고정화된 효소의 양은 고정화하기 전에 채취한 샘플과, 고정화한 후에 채취한 샘플의 단백질 농도차이를 이용해 계산하였다. 단백질 농도는 UV-spectrophotometer(Shimadzu UVmini-1240)를 이용해 562 nm에서 BCA 방법으로 측정하였다.
- 농도가 1, 2, 4, 8, 10, 20% (w/v)인 셀룰라아제 용액에서 고정화한 각각의 비드 1 g씩을 1% (w/v) CMC 1 mL에 각각 넣어 50℃에서 5분간 반응시켜 생성된 포도당의 농도를 측정하였다. 포도당 농도는 UV-spectrophotometer를 이용해 500 nm에서 포도당 측정용 시액 (아산셋트, 아산제약주식회사)으로 측정하였다.
- 농도가 1, 2, 4, 8, 10, 20% (w/v)인 셀룰라아제 용액에서 고정화한 각각의 비드 1 g씩을 1% (w/v) CMC 1 mL에 각각 넣어 50℃에서 5분간 반응시켜 생성된 포도당의 농도를 측정하였다. 포도당 농도는 UV-spectrophotometer를 이용해 500 nm에서 포도당 측정용 시액 (아산셋트, 아산제약주식회사)으로 측정하였다. 효소의 활성단위 1 unit은 50℃에서 1분 동안 기질로부터 1 μmol의 환원당을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.
- 가교제로서 ECH를 사용할 경우, 키토산의 양이온 아민 그룹을 제거하지 않고 키토산 막의 습윤강도를 상당히 강화시키는 장점이 있다 [16]. 본 연구에서 키토산은 비드의 형태를 만드는데 사용되었고, 셀룰라아제는 maleic anhydride로 변형시킨 PVA 막으로 코팅된 키토산 비드에 고정화되었다. 변형된 PVA를 사용함으로써 고정화된 셀룰라아제의 3차구조를 보존하여 pH 및 온도 안정성을 향상시키고, 최적 pH가 4.
- 0으로 이동됨이 보고되었다 [11]. 따라서 본 연구에서는 변화된 효소의 최적 pH인 7.0에서 실험을 진행하였다. 효소 고정화시 가교제인 ECH를 첨가하면 비드 표면의 히드록시기와 효소의 아미노기 사이에 가교결합이 일어나 공유결합으로 효소를 고정화시킬 수 있으나, 본 연구에서는 고정화시 ECH를 첨가하지 않았으므로 효소는 흡착에 의해 고정화되었다.
- 0에서 실험을 진행하였다. 효소 고정화시 가교제인 ECH를 첨가하면 비드 표면의 히드록시기와 효소의 아미노기 사이에 가교결합이 일어나 공유결합으로 효소를 고정화시킬 수 있으나, 본 연구에서는 고정화시 ECH를 첨가하지 않았으므로 효소는 흡착에 의해 고정화되었다.
- 고정화 효소의 최대 비활성도가 존재하는 이유는 효소용액의 농도가 증가함에 따라 기질과 결합하는 효소가 점점 포화상태에 이르게 되면서 어느 농도 이상에서는 고정화된 효소의 증가량만큼 포도당이 비례해서 생성되지 않기 때문으로 생각된다. 본 연구를 통해 생산한 포도당을 효모의 탄소원으로 이용하여 바이오 에탄올 생산에 적용하고자 온도조건은 37℃로 설정하였다.
- 이상과 같이 키토산을 기반으로 한 비드를 제조하고 셀룰라아제를 비드 표면에 고정화할 때의 최적 셀룰라아제 용액 농도 및 셀룰로오스로부터 포도당 생산을 위한 최적 반응 조성을 구하였다. 본 결과는 셀룰로오스 기반 바이오연료 및 바이오케미칼 생산을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
대상 데이터
- 셀룰라아제는 20% (w/v) Viscozyme으로 Novozyme에서 구입하였다. 키토산 (75% 이상 탈아세틸화, 용해도: 10 g/L of 1 M acetic acid), 폴리비닐알콜 (PVA, 평균 분자량 31,000~50,000), sodium tripolyphosphate (TPP), sodium carboxymethyl cellulose (CMC, 평균 분자량: 90,000, extent of labeling: 0.
- 셀룰라아제는 20% (w/v) Viscozyme으로 Novozyme에서 구입하였다. 키토산 (75% 이상 탈아세틸화, 용해도: 10 g/L of 1 M acetic acid), 폴리비닐알콜 (PVA, 평균 분자량 31,000~50,000), sodium tripolyphosphate (TPP), sodium carboxymethyl cellulose (CMC, 평균 분자량: 90,000, extent of labeling: 0.7 carboxymethyl groups per anhydroglucose unit)는 Sigma-Aldrich 사에서 각각 구입하였다. Maleic anhydride는 Fluka 사에서 구입하였으며, 가교제로 쓰인 epichlorohydrin (ECH)은 TCI 사에서 구입하였다.
- 7 carboxymethyl groups per anhydroglucose unit)는 Sigma-Aldrich 사에서 각각 구입하였다. Maleic anhydride는 Fluka 사에서 구입하였으며, 가교제로 쓰인 epichlorohydrin (ECH)은 TCI 사에서 구입하였다.
이론/모형
- 고정화된 효소의 양은 고정화하기 전에 채취한 샘플과, 고정화한 후에 채취한 샘플의 단백질 농도차이를 이용해 계산하였다. 단백질 농도는 UV-spectrophotometer(Shimadzu UVmini-1240)를 이용해 562 nm에서 BCA 방법으로 측정하였다.
- 효소의 고정화 방법은 효소를 물리적으로 가두는 포획법과 지지물질의 표면에 흡착과 공유결합에 의하여 부착하는 결합법으로 나눌 수 있다. 본 연구에서는 포획법을 이용할 경우 거대분자인 셀룰로오스가 셀룰라아제 효소와 접촉하기 위해 확산제한이 일어날 수 있으므로 이를 극복하기 위하여 키토산 비드 표면에 셀룰라아제를 고정화시키는 Dincer와 Telefonce[11]의 방법을 이용하였다.
성능/효과
- 2는 셀룰라아제 용액의 농도에 따라 비드에 고정화된 셀룰라아제의 양을 측정한 결과이다. 비드에 효소를 고정화하기 전과 후의 셀룰라아제 용액의 단백질 농도 차이를 BCA 방법으로 측정하여 계산한 결과, 효소 용액의 농도가 20%까지 증가함에 따라 일정한 비드의 양에 고정화되는 단백질이 양이 거의 선형적으로 증가하는 것이 관찰되었다. 고정화된 셀룰라아제의 양은 비드 1 g당 4 mg (1% 셀룰라아제 용액)에서 36 mg (20% 셀룰라아제 용액)까지 증가하였다.
- 3은 각각의 셀룰라아제 용액의 농도에서 고정화시킨 비드로 생성된 포도당의 농도 및 이를 바탕으로 각 셀룰라아제 용액의 농도에서 고정화시킨 비드가 나타내는 효소의 비활성도를 계산한 값이다. 셀룰라아제 용액의 농도가 증가할수록 8%까지는 포도당의 생성량이 급격히 증가하다가 그 이후로는 천천히 증가하는 것으로 관찰되었다. 최대 포도당 생성량은 20% 셀룰라아제 용액에서 고정시킨 경우 7.
- 2 g/L였다. 본 연구에서 기질로 사용한 1%의 CMC는 extent of labeling이 0.7 carboxymethyl groups per anhydroglucose unit으로 모노머 환산 0.0459 mol/L에 해당하며, 최대로 생성된 포도당 7.2 g/L는 0.04 mol/L에 해당하므로 가수분해 전환율은 87.2%로 계산된다. 가수분해 전환율이 100%에 도달하지 못한 이유는 고정화에 사용된 20%의 효소용액 농도 또는 5분의 가수분해 시간이 100% 전환에 부족하기 때문으로 생각된다.
- 가수분해 전환율이 100%에 도달하지 못한 이유는 고정화에 사용된 20%의 효소용액 농도 또는 5분의 가수분해 시간이 100% 전환에 부족하기 때문으로 생각된다. 효소의 비활성도를 계산한 결과 8%의 셀룰라아제 용액에서 고정화시킨 비드가 효소의 비활성도 값이 0.37 unit/mg protein으로 가장 높으므로 가장 효율적인 효소 고정화 농도임을 알 수 있었다. 고정화 효소의 최대 비활성도가 존재하는 이유는 효소용액의 농도가 증가함에 따라 기질과 결합하는 효소가 점점 포화상태에 이르게 되면서 어느 농도 이상에서는 고정화된 효소의 증가량만큼 포도당이 비례해서 생성되지 않기 때문으로 생각된다.
- 가장 효율적인 효소 고정화 농도인 8% 셀룰라아제 용액에서 고정화시킨 비드의 농도에 따라 일정한 기질의 양에서 생성된 포도당의 농도를 관찰한 결과, Fig. 4에 나타난 바와 같이 1% CMC 기질에서 0.25 g/L의 비드를 사용한 경우 생성된 포도당의 최대 농도는 60분 경과 후 3.8 g/L였으며, 그 이후로는 거의 일정하게 유지되었다. 0.
- 37 unit/mg protein이었다. pH 7, 37℃에서 최적 반응 조성은 1% CMC 기질로부터 0.5 g beads/L였으며, 포도당으로의 전환은 약 20분에 완료되었다.
후속연구
- 이상과 같이 키토산을 기반으로 한 비드를 제조하고 셀룰라아제를 비드 표면에 고정화할 때의 최적 셀룰라아제 용액 농도 및 셀룰로오스로부터 포도당 생산을 위한 최적 반응 조성을 구하였다. 본 결과는 셀룰로오스 기반 바이오연료 및 바이오케미칼 생산을 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
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