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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 백선의 간세포에 대한 영향을 세포 수준에서 고찰함으로서 백선의 세포독성에 대한 독성발현기전을 파악하고 무분별한 생약자원의 남용에 대한 경각심을 제고하기 위하여 인체유래 간세포를 이용하여 세포 영향성 인자의 변화에 대한 조사를 수행하였다.
- 본 연구에서는 백선의 인체유래 간세포에 대한 세포사멸 관련 인자들에 대한 변화를 관찰함으로써 동물실험과 임상에서 발견되는 백선에 의한 간독성의 과학적 근거를 뒷받침 하고자 하였다. 세포자살(Apoptosis)은 세포 내·외부의 여러 가지 요인에 의해서 세포 스스로가 파괴되는 일련의 기작을말한다.
제안 방법
- USA(CAT. HB-8065)에서 분양받아 사용하였으며, 배지는 Eagle's Minimum Essential Medium(ATCC, Cat No. 30-2003)에 10% Fetal Bovine Serum(FBS, ATCC, Cat No. 30-2020)를 혼합하였고 1% Penicillin Streptomycin (Gibco, Cat no. 15140-122)을 첨가하여 제조하였다.
- 세포자살과 관련된 단백질의 추출을 위하여 시료를 처리한 resuspend cell에 200㎕ PRO-PREP™(Intron, Cat No. 17081) 용액을 첨가하여 풀어준 후, 얼음에서 20분간 incubation한뒤, 13,000rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 그 상등액을 취하였다.
- 실험용 시료제조를 위하여 백선피 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약 110℃로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다. 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.
- 15140-122)을 첨가하여 제조하였다. 또한 습도 95%, CO2 5%, 온도 37℃ 등의 조건에서 배양하여 사용하였다.
- 23225)의 working reagent 2,000㎕을 혼합한 뒤 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이를 ELISA reader(Bio-TEK instrument, ELx808)를 이용하여 565nm에서 측정하였다.
- cells/well의 농도로 분주한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. serum-free EMEM으로 교체해준 후에 백선추출물을 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리하였으며, 24시간(48시간) 배양 후 media를 걷어내고 20㎕의 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT, 5㎎/㎖)을 넣은 뒤, CO2 배양기에서 2시간 배양하였다. 100㎕의 DMSO로 결정을 용해시킨 후에 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 100㎕의 DMSO로 결정을 용해시킨 후에 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 control과 비교하여 %로 표시하였으며, 세포에 처리한 샘플에 포함된 DMSO는 최종농도 0.1%에 맞추었다.
- 세포배양 및 시료의 처리는 MTT assay와 동일한 방법으로 수행하였으며, LDH elisa kit(Abcam. Cat. ab65393)를 이용하여 측정하였다.
- 백선의 인체유래 간세포에 대한 영향을 조사하기 위하여 apoptosis array kit를 이용하였다. 먼저 정량한 단백질 중 250㎍을 취하여 apoptosis array kit (RnDsystems, Cat No.
- 5㎖ 첨가하여 1시간 반응한 후 일련의 세척과정을 마쳤다. Streptabidin-HRP를 2㎖ 첨가하여 30분의 반응 및 일련의 세척과정을 마친 후, Chemi Reagent를 1:1로 섞어 membrane 위에 가하여 발광시키고, Image Analysis System (ChmiDocTM XRST with Image LabTM software, BIO-RAD)을 이용하여 caspase-3, cytochrome C, Bax 및 Bcl-2의 값을 측정하였다.
- DPBS 로 각 well을 세척한 후, DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit(Abcam, Cat No. ab113851)의 2'7'-dichloro fluorescein diacelate(DCFDA)이 포함된 형광염료를 각 well에 100㎕씩 첨가하여 30분간 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
- ROS에 의한 세포의 산화적 스트레스 정도를 조사하기 위하여 ROS detection assay kit를 이용하였다. 먼저 96 well plate의 각 well에 세포주(HepG2) 1×104 cells/㎖을 100㎕씩 넣고 24시간 동안 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
- DCFDA를 제거한 후 시험물질을 포함한 배양액 100㎕를 넣고 24시간 동안 배양하였다. 이후 세포의 형광광도(Bio-TEK instrument, Synergy2)를 측정하였다.
- 백선 추출물의 HepG2 cell에 대한 ROS 생성량을 측정하기 위하여 0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리한 뒤 ROS detection assay kit를 이용하였다. 그 결과 농도 의존적으로 ROS의 생성량이 증가하였으며, 5.
- 세포자살(Apoptosis)은 세포 내·외부의 여러 가지 요인에 의해서 세포 스스로가 파괴되는 일련의 기작을말한다. 이러한 세포자살과 관련된 여러 가지 인자들이 밝혀져 있으며, 본 연구에서는 이들 가운데 Caspase 3, Cytochrome C, Bcl 2, Bax, ROS 등의 변화를 측정함으로써 백선의 인체 간세포에 대한 영향을 확인 하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용한 백선은 (주)퓨어마인드(yongchoen, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 실험용 시료제조를 위하여 백선피 500g을 추출기에 넣고 증류수를 4ℓ를 넣은 후, 약 110℃로 4시간동안 추출하고 나온 추출액을 병에 담았다.
- 열이 적당히 식으면 여과지로 여과하여 냉동으로 보관하고 추출액을 감압농축기로 농축을 실시하였다. 농축된 시료를 동결건조기로 약 3일 동안 동결건조 하여 수득률 23.7%로 백선추출물 23.5㎎을 얻었으며 이를 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 HepG2 cell line은 ATCC. USA(CAT.
데이터처리
- 본 시험에서 얻은 측정치들은 ANOVA 분석을 실시하였으며, 최종 검정은 Dunnett's t-test를 이용하여 통계학적 유의성을 검정하였다(p < 0.05).
성능/효과
- MTT 및 LDH assay를 통하여 백선 추출물의 HepG2 cell에 대한 독성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었으며, IC50은 5.0㎎/㎖/48h로 확인되었다(Fig. 1).
- 백선 추출물을 0, 0.1, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리한 뒤 apoptosis array kit를 이용하여 Caspase 3의 생성을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 발현량이 증가하는 것을 확인 하였다(Fig. 2).
- 백선 추출물을 0, 0.1, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리한 뒤 apoptosis array kit를 이용하여 Cytochrome C의 생성을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 발현량이 증가하는 것을 확인 하였다(Fig. 3).
- 백선 추출물을 0, 0.1, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리한 뒤 apoptosis array kit를 이용하여 Bcl 2의 생성을 측정한 결과 최저 농도에서 가장 많이 증가하였으며 농도가 높아질수록 대조군과 차이가 감소하는 것을 확인 하였다(Fig. 4).
- 백선 추출물을 0, 0.1, 1.0, 5.0㎎/㎖로 처리한 뒤 apoptosis array kit를 이용하여 Bax의 생성을 측정한 결과 최저 농도에서 발현이 감소하였으나, 농도가 높아질수록 대조군과 비교하여 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 5).
- 0㎎/㎖로 처리한 뒤 ROS detection assay kit를 이용하였다. 그 결과 농도 의존적으로 ROS의 생성량이 증가하였으며, 5.0㎎/㎖에서 급속하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 결과에서 알 수 있듯이 Caspase 3, Cytochrome C, ROS 등은 농도 의존적으로 발현이 증가하였다. 또한 Bcl 2과 Bax의 생성에 있어서도 뚜렷한 유의성을 보이지는 않았으나, 일정한 변화를 나타내는 것을 확인하였다.
- 결과에서 알 수 있듯이 Caspase 3, Cytochrome C, ROS 등은 농도 의존적으로 발현이 증가하였다. 또한 Bcl 2과 Bax의 생성에 있어서도 뚜렷한 유의성을 보이지는 않았으나, 일정한 변화를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 백선이 인체세포 특히 간세포에 대한 민감성을 나타낸다는 증거이며, 과량 혹은 장기간의 경구투여가 인체 간세포에 일정한 손상을 줄 수 있음을 시사한다.
- 1. 백선추출물은 HepG2 cell에 대하여 농도 의존적으로 독성을 나타내었으며, IC50은 5.0㎎/㎖(48hr)로 확인되었다.
- 2. 백선추출물은 HepG2 cell에 대하여 Caspase 3, Cytochrome C의 생성을 농도 의존적으로 증가시켰으며, 이를 통하여 백선이 인체 간세포의 Apoptosis를 유발하거나 촉진하는 물질임을 알 수 있었다.
- 3. 백선추출물은 HepG2 cell에 대하여 ROS(Reactive Oxygen Species)의 생성을 증가시켜 세포 내에 산화적 스트레스를 유발함으로써 세포의 생존율에 영향을 주는 것으로 확인되었다.
- 4. 백선추출물은 HepG2 cell의 Bcl 2과 Bax의 생성에 대하여 농도 의존적인 변화를 보이는 않았으나, 일정한 변화를 나타내었으며, 이 또한 백선이 인체 간세포에 대하여 특정한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
- 5. 백선은 인체 유래 간세포 HepG2 cell의 세포자살과 관련된 여러 인자들의 생성 및 발현을 유도하며, 이를 통하여 간세포의 기능이상 및 사멸에 관여하는 것으로 판단된다.
후속연구
- 최근에는 백선이 가지고 있는 다양한 효능, 효과가 과학적으로 입증되고 새로운 효능이 발견되는 추세에 있어 더욱 관심의 대상이 되고 있다11,12,21). 따라서 백선피의 안전성에 대한 과학적 검증이 반드시 필요한 상황이며, 이를 토대로 백선의 다양한 활용분야를 개발할 수 있을 것으로 기 대한다.
- 이러한 결과는 백선이 인체세포 특히 간세포에 대한 민감성을 나타낸다는 증거이며, 과량 혹은 장기간의 경구투여가 인체 간세포에 일정한 손상을 줄 수 있음을 시사한다. 이 같은 결과를 통하여 학계에 보고되어 온 백선 관련 중독과 부작용에 대하여 일정부분 근거를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
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