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문제 정의
- 본 연구에서는 작약 에탄올 추출물이 고지방식이 유발 비만/당뇨 마우스모델 동물실험에서 혈당 강하 효능이 있음을 확인함과 동시에, 추출물과 용매 분획물에 대하여 제2형 당뇨 관련 타겟에 대한 활성을 검색함으로써 작약의 혈당 강하 효능이 어떤 기전에서 유래 하였는지 검증하고자 하였다.
제안 방법
- PTP1B 활성 검색 − p-NPP를 기질로 이용하여 탈인산화 정도를 측정하여 PTP1B에 대한 저해활성을 검색하였다.
- TransFastTM Transient transfection kit(Promega, USA)을 이용하여 pcDNAhPPARα, pcDNA-hPPARδ, pcDNA-hPPARγ, 또는 pcDNAhRXRα expression plasmid와 PPRE-Luc reporter plasmid, pRL-SV40 plasmid(Promega, U.S.A.)를 transfection시켰다.
- Transfection 다음날 특정 농도의 추출물 및 분획물들과 positive control인 WY14643(PPARα; 10 µM), GW501516 (PPARδ; 1 µM), troglitazone(PPARγ; 10 µM), 또는 9-cis retinoic acid(RXRα; 10 µM)을 처리하고 24시간 배양하였다.
- , Seongnam, Korea)과 3군의 고지방식이군(60% kcal fat, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ)으로 나누어 8주간 실험을 진행했다. 고지방식이군 중 한 군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취시켰고(HFD군), 나머지 두군은 각각 500 mg/kg metformin(MET군)을, 다른 한 군은 100 mg/kg 작약 EtOH 추출물(PL군)을 1일 1회 8주 동안 경구투여 하였다. 실험기간 동안 몸무게, 사료섭취량, 물섭취량을 매일 측정하였다.
- 7주령의 웅성(雄性) 마우스(C57BL/6) 32마리를 Shizuoka Laboratory Animal Center(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)사에서 구입하여 1주일동안 12시간 조명주기와, 항온(23±2℃), 항습(55±5%)하에 적응시켰다. 그룹 당 8마리씩 4그룹으로 분리한 후, 정상식이군(Con군: 10% kcal fat, 38057, Purina Inc., Seongnam, Korea)과 3군의 고지방식이군(60% kcal fat, D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ)으로 나누어 8주간 실험을 진행했다. 고지방식이군 중 한 군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취시켰고(HFD군), 나머지 두군은 각각 500 mg/kg metformin(MET군)을, 다른 한 군은 100 mg/kg 작약 EtOH 추출물(PL군)을 1일 1회 8주 동안 경구투여 하였다.
- 본 연구팀이 수행한 이전 연구결과를 바탕으로15) 작약의 혈당 강하 효능을 검증하기 위하여 고지방식이로 유발된 당뇨/비만 C57BL/6 마우스모델에 metformin을 양성대조군으로 하여 작약 EtOH 추출물을 경구투여 하였다. 8주 동안 마우스의 체중 변화를 측정한 결과, MET군은 뚜렷한 체중 감소 효능을 보인데 반해, PL군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취한 군(HFD군)과 비교하여 유의성 있는 변화를 보여주지 않았다(Fig.
- 세포용해액을 대상으로 Dual-Glo® assay kit(Promega, USA)을 이용하여 Luciferase assay를 수행하였다.
- 고지방식이군 중 한 군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취시켰고(HFD군), 나머지 두군은 각각 500 mg/kg metformin(MET군)을, 다른 한 군은 100 mg/kg 작약 EtOH 추출물(PL군)을 1일 1회 8주 동안 경구투여 하였다. 실험기간 동안 몸무게, 사료섭취량, 물섭취량을 매일 측정하였다. 몸무게 증가는 실험기간 동안 증가한 평균몸무게로 나타내었으며, 식이효율(food efficiency ratio; FER)은 몸무게 증가량을 식이섭취량으로 나눈 값으로 나타내었다.
- 몸무게 증가는 실험기간 동안 증가한 평균몸무게로 나타내었으며, 식이효율(food efficiency ratio; FER)은 몸무게 증가량을 식이섭취량으로 나눈 값으로 나타내었다. 실험이 종료된 후 혈당은 안와정맥총에서 채혈하여 Accu-Chek(Roche Diagnostics) 혈당기로 측정되었다.
- 이러한 동물실험 결과를 바탕으로 본 연구팀은 작약의 혈당 강하 효능이 발현되는 기작과 유효 성분이 포함된 분획을 추적하고자 작약의 EtOH 추출물에 대한 용매 분획물을 제조하고 PPARs와 RXRα 유전자가 transfection된 세포에 처리하여 luciferase assay를 통해 PPARs 및 RXR에 대한 활성 능력을 측정하였으며, 각 시료에 대한 PTP1B 효소 억제 효능 역시 검증하였다(Fig. 2).
- 작약 (300 g)은 ethyl alcohol(EtOH)(3 L)로 3시간 동안 초음파추출기를 이용하여 추출하였고, 여과한 후 회전농축기로 감압, 농축시켰다. 작약의 EtOH 추출물(78 g)을 증류수(1 L)로 현탁한 후 n-hexane, methylene chloride, ethyl acetate를 이용하여 순차적으로 용매 추출하고 농축시켜, 작약 ethyl alcohol 추출물(EtOH) 외에, n-hexane 분획물(Hx), methylene chloride 분획물(MC), ethyl acetate 분획물(EA), 물 분획물(DW) 등 4종의 시료를 추가 제조하였다.
- 세포용해액을 대상으로 Dual-Glo® assay kit(Promega, USA)을 이용하여 Luciferase assay를 수행하였다. 측정은 luminometer(Promega, USA)로 firefly와 renilla luciferase의 활성을 측정하여 각 추출물 및 분획물의 PPAR 및 RXR에 대한 활성 능력을 비교하였다.11)
대상 데이터
- )에서 구입하였고, 기질인 para-nitrophenyl phosphate(p-NPP)는 New England Biolabs, Inc.(Beverly, MA, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다.
- )에서 구입하였으며, GW501516은 Santa Cruz Inc.(Santa Cruz, CA, U.S.A.)에서 구입하여 사용하였다. Recombinant human PTP1B는 BIOMOL Research Laboratories, Inc.
- 7주령의 웅성(雄性) 마우스(C57BL/6) 32마리를 Shizuoka Laboratory Animal Center(Hamamatsu, Shizuoka, Japan)사에서 구입하여 1주일동안 12시간 조명주기와, 항온(23±2℃), 항습(55±5%)하에 적응시켰다.
- 생약 및 생약 시료의 조제 − 실험에 사용한 작약은 삼홍 건재약업사에서 구입하여 사용하였으며, 증거표본(MNUYG-011)은 목포대학교 약학대학 표본실에 보관 중이다.
데이터처리
- 두 그룹간 통계적 유의성 검사는 Student’s t-test를 사용하였으며, P<0.05 인 경우 통계적으로 유의하다고 평가하였다.
- 통계처리 − 자료는 동물실험의 경우 평균±표준오차, 세포실험의 경우 평균±표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 2) 각 타겟 관련 개발된 약물을 보면, PPARα 리간드인 fibrate 계열 약물은 현재 고지질증 치료제로 사용되고 있으며, PPARγ 효능제인 thiazolidinedione(TZD) 계열 약물은 당뇨 치료제로 사용되었지만, 심혈관 부작용으로 인해 퇴출되었다.
- 작약의 혈당 강하 효능을 검증하기 위하여 고지방식이로 유발된 당뇨/비만 C57BL/6 마우스모델에 metformin을 양성대조군으로 하여 작약 EtOH 추출물을 경구투여 하였다. 8주 동안 마우스의 체중 변화를 측정한 결과, MET군은 뚜렷한 체중 감소 효능을 보인데 반해, PL군은 약물투여 없이 고지방식이만을 섭취한 군(HFD군)과 비교하여 유의성 있는 변화를 보여주지 않았다(Fig. 1A). 또한 PL군의 식이섭취량(food intake) 및 식이효율(FER) 역시 HFD군과 차이가 없어 전반적으로 크게 좋은 효능을 보이지는 않았다(Table I).
- PPARγ 의 활성은 대조약물인 triglitazone(TRO)에 비하여 약하지만 모든 유기용매 분획물에서 전반적으로 좋은 활성을 보였다.
- 각 추출물을 동일 농도(100 µg/mL)에서 비교한 결과, PPARα에 대한 활성(Fig. 2A)은 Hx 분획물이 EtOH 시료 투여군과 비교하여 3배 이상 높은 활성을 보여주었고, MC층도 2배로 강한 효능을 보였다.
- 고지방식이 유발 당뇨/비만모델 마우스 동물실험을 통해 확인한 결과, 작약 추출물은 유의성 있는 혈당 강하 효능을 보여주었다. 이러한 항당뇨 효능에 관여하는 타겟과 그 효능 분획을 밝히기 위하여 검색한 결과, 작약의 Hx 분획물이 가장 좋은 PPARα과 PPARγ 효능을 보였으며, PTP1B 억제 효능 또한 우수하였다.
- 그러나 8주 후 공복혈당을 측정한 결과, 작약 추출물 PL군의 혈당치가 196±14.55 mg/dl로 HFD군(249±30.30 mg/dl)에 비해 뚜렷한감소를 나타내었고, 이는 대조약물 투여군인 MET군 (191.43±7.30 mg/dl)에 필적함을 보여주었다(Fig. 1C).
- 다른 당뇨 치유 목표기작 중 하나인 PTP1B 활성을 검색한 결과 EA 분획물(IC50 10 µg/mL) 이 높은 활성을 보였으며 다음으로 Hx 분획물(IC50 24.6 µg/ mL)과 MC 분획물(IC50 48.7 µg/mL)이 좋은 효능을 보였으며(Table II), 이 결과 또한 혈당강하 효능에 일조를 했으리라 여겨진다.
- 실험기간 동안 몸무게, 사료섭취량, 물섭취량을 매일 측정하였다. 몸무게 증가는 실험기간 동안 증가한 평균몸무게로 나타내었으며, 식이효율(food efficiency ratio; FER)은 몸무게 증가량을 식이섭취량으로 나눈 값으로 나타내었다. 실험이 종료된 후 혈당은 안와정맥총에서 채혈하여 Accu-Chek(Roche Diagnostics) 혈당기로 측정되었다.
- 상기 결과를 종합할 때, 제2형 당뇨와 관련된 작약의 혈당강하 효능은 단순히 하나의 표적에 작용하는 효능이라기 보다는 PPARα와 γ 그리고 PTP1B 등이 복합적으로 효능을 발휘하게 하는 것으로 사료되어진다.
- 1C). 이 결과를 종합해 보면 작약 추출물은 고지방식이로 유발되는 당뇨에서 혈당을 강하시키는 효능을 유의성 있게 나타내나, 비만과 관련해서는 효능을 보이지 않는 것으로 보인다. 중국의 한 그룹에서 비알코올성 지방간 모델에서 작약의 총 당추출물이 인슐린저항성을 개선하고, 지질프로파일을 개선함을 보고하였는데, 이는 본 작약추출물도 비슷한 기전으로 작용하여 인슐린 저항성을 개선하여 혈당을 강하시키는 효능을 나타내었을 것으로 추정할 수 있다.
- 이러한 항당뇨 효능에 관여하는 타겟과 그 효능 분획을 밝히기 위하여 검색한 결과, 작약의 Hx 분획물이 가장 좋은 PPARα과 PPARγ 효능을 보였으며, PTP1B 억제 효능 또한 우수하였다.
- 2). 활성 검색 결과, 작약의 EtOH 추출물에서 유래한 유기용매 분획물 Hx, MC 및 EA시료가 모(母) 추출물인 EtOH 시료에 비하여 전반적으로 효능이 강하게 나타났다. 각 추출물을 동일 농도(100 µg/mL)에서 비교한 결과, PPARα에 대한 활성(Fig.
후속연구
- 13) 또한 작약은 phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)의 유전자 발현을 억제함으로써 혈당강하 효과를 나타낸다고 보고되어 있으며,7) 작약 ethyl acetate 추출물에서 분리된 monoterpene glycoside계 paeoniflorin과 8-debenzoylpaeoniflorin을 streptozotocin(STZ)으로 유발한 당뇨모델 랫에 정맥투여시 혈당강하 효능을 나타낸다는 보고가 있다.14) 그러나 당뇨환자의 대부분이 제2형 당뇨병이며, 서구화된 식생활과 활동량의 감소로 비만인구가 늘어나면서 당뇨유병률이 증가하는 추세를 고려한다면, 고지방식이로 유도된 당뇨/비만 동물모델을 이용한 효능평가와 관련 타겟의 활성평가 등이 추가로 이루어져야 한다고 여겨져 본 실험을 진행하였다.
- 이로써 작약의 혈당 강하 효능은 PPARα, PPARγ, PTP1B 등이 복합적으로 작용하는 것으로 여겨지며 작약의 분획물 중 Hx 분획물이 전반적으로 가장 효능이 우수하여 유효성분 연구를 진행 중에 있다. 또한 유효성분 분리 후에는 인슐린 민감도와 관련된 단백질의 발현 및 인산화를 측정하여 인슐린 신호전달 관련 시그널 중 어느 부분에 작약의 효능성분이 작용하여서 혈당강하효능을 나타내는지에 대한 기전연구를 수행할 예정이다.
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