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문제 정의
- 국내에서는 감귤, 오이, 딸기 등에 발생하는 다양한 식물병의 방제를 위해서 strobilurin계 살균제가 단제 또는 혼합제의 형태로 여러 식물병을 대상으로 등록되어 사용되고 있기 때문에, 많은 병 방제를 위해서 여러 번 살균제를 처리할 경우에 약제저항성이 발생할 가능성이 높다. 따라서 본 연구에서는 오이, 토마토, 딸기, 인삼 등에서 분리한 잿빛곰팡이병균을 사용하여 strobilurin계 살균제에 대한 실내 저항성 검정을 확립하고, 포장에서 분리한 균주에 대한 저항성 검정을 실시하여 저항성의 기준을 설정하고자 하였으며, azoxystrobin에 대해서 저항성인 균주가 다른 strobilurin계 살균제와 교차저항성이 있는지의 여부를 조사하였다.
- 0과 100 µg mL−1의 azoxystrobin과 100 µg mL−1 SHAM을 첨가한 PDA배지에서 생장이 가능한 균주를 저항성 균주로 구분하였다. 본 실험에서는 azoxystrobin에 대한 각 균주들의 EC50값을 구하여 감수성과 저항성 반응을 구분하고자 하였다. Azoxystrobin의 처리농도에 대해서 실험에 사용한 101개의 B.
제안 방법
- Azoxystrobin에 대해서 감수성과 저항성 균주로 판명된 11-20과 11-74를 선발하여 동일한 strobilurin계 살균제로 알려진 kresoxim-methyl과 trifloxystrobin에 대한 교차 저항성 여부를 조사하였다(Fig. 7). 그 결과 azoxystrobin에 대해서 감수성이었던 B.
- PDA배지에서 세균의 오염을 방지하기 위해서 300 µg mL−1의 streptomycin을 첨가하였다.
- Strobilurin계 살균제인 azoxystrobin (a.i. 98.45%, Tech.), kresoxim-methyl (a.i. 44.2% SC), trifloxystrobin (a.i. 22% SC)을 사용하여 잿빛곰팡이병균의 살균제에 대한 감수성 정도를 조사하였다.
- 계산한 균사생장 억제율을 가지고서 각 B. cinerea 균주에 대한 살균제의 EC50값을 구하여 살균제에 대한 감수성과 저항성의 분포를 비교하였다.
- 고저항성은 100 µg mL−1 azoxystrobin을 처리한 PDA배지에서 B. cinerea의 생장을 무처리 배지에서 생장과 비교하여 50% 이상이 생장한 경우로 구분하였고, 1.0 µg mL−1 azoxystrobin을 처리한 PDA배지에서 B. cinerea의 생장이 무처리배지에서의 50% 이상이 되고, 100 µg mL−1를 첨가한 PDA 배지에서는 생장하지 못하는 경우를 저저항성으로 구분하였다.
- 이 때 petri dish에는 멸균수를 적신 여과지(직경; 90 mm)를 깔아 내부의 습도가 포화 상태로 유지되도록 하였다. 단포자 분리를 위해서 병징 표면에 형성된 포자를 현미경으로 관찰하며 capillary tube (직경; 1.5 mm, 길이; 90 mm)를 사용하여 포자를 한 개 씩 떼어내어 물한천배지에 치상하였다. 배지에서 2일간 배양한 후, 형성된 균사 끝을 떼어내어 PDA (potato dextrose agar, Difco) 배지에 이식하고 20oC항온기에서 3일간 배양하였다.
- 또한 병원균의 대체호흡을 억제하기 위해서 PDA배지에 SHAM (salicylhydroxamic acid)을 100 µg mL−1가 되도록 첨가하였다.
- 물론 이 때도 azoxystrobin에 대한 병원균의 반응을 검정하기 위해서 PDA배지에 100 µg mL−1의 SHAM을 첨가하여 실험하였다.
- cinerea 균주를 PDA 배지에 접종한 후 20oC의 암상태에서 4일간 배양하고균사선단 부위에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어내어 각 살균제를 정해진 농도별로 첨가한 PDA 배지에 접종하였다. 병원균을 접종한 배지는 20oC에서 4일간 배양한 후 균총의직경을 측정하고, 아래 식에 의해서 균사생장 억제율(%)을 계산하였다.
- 살균제의 효과는 병원균에 대한 균사생장 억제 효과를 조사하여 검정하였다. 분리한 B. cinerea 균주를 PDA 배지에 접종한 후 20oC의 암상태에서 4일간 배양하고균사선단 부위에서 직경 3 mm의 균사 조각을 떼어내어 각 살균제를 정해진 농도별로 첨가한 PDA 배지에 접종하였다. 병원균을 접종한 배지는 20oC에서 4일간 배양한 후 균총의직경을 측정하고, 아래 식에 의해서 균사생장 억제율(%)을 계산하였다.
- 또한 병원균의 대체호흡을 억제하기 위해서 PDA배지에 SHAM (salicylhydroxamic acid)을 100 µg mL−1가 되도록 첨가하였다. 살균제의 효과는 병원균에 대한 균사생장 억제 효과를 조사하여 검정하였다. 분리한 B.
- 실험에 사용한 살균제를 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Junsei Chemical Co., Ltd.)로 용해한 후 멸균한 PDA배지에 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 µg mL−1의 농도가 되도록 첨가하였다.
- 잿빛곰팡이병균은 2011년 2월부터 3월 사이에 경기, 경남, 부산, 충남 지역에서 채집한 병든 고추, 딸기, 오이와 토마토의 열매를 채집한 후 단포자를 분리하였다. 채집한 시료에서 건전 부위와 발병 부분을 함께 적당한 크기로 잘라 petri dish (직경; 90 mm, 높이; 15 mm)에 넣고 20oC 항온기에서 2일간 광처리를 하여 포자를 발생시켰다. 이 때 petri dish에는 멸균수를 적신 여과지(직경; 90 mm)를 깔아 내부의 습도가 포화 상태로 유지되도록 하였다.
대상 데이터
- 잿빛곰팡이병이 발생한 고추, 딸기, 오이와 토마토의 열매에서 병원균인 Botrytis cinerea를 단포자 분리하여 실험에 사용하였다. 잿빛곰팡이병균은 2011년 2월부터 3월 사이에 경기, 경남, 부산, 충남 지역에서 채집한 병든 고추, 딸기, 오이와 토마토의 열매를 채집한 후 단포자를 분리하였다. 채집한 시료에서 건전 부위와 발병 부분을 함께 적당한 크기로 잘라 petri dish (직경; 90 mm, 높이; 15 mm)에 넣고 20oC 항온기에서 2일간 광처리를 하여 포자를 발생시켰다.
- 잿빛곰팡이병균은 병든 고추, 딸기, 오이와 토마토에서 각각 11균주, 50균주, 10균주, 30균주 등 총 101개의 균주를 분리하여 실험에 사용하였다. 분리된 균주들을 지역별로 나누어보면 경기에서 14균주, 경남에서 31균주, 부산에서 19 균주, 충남에서 37균주를 분리하였다.
- 잿빛곰팡이병이 발생한 고추, 딸기, 오이와 토마토의 열매에서 병원균인 Botrytis cinerea를 단포자 분리하여 실험에 사용하였다. 잿빛곰팡이병균은 2011년 2월부터 3월 사이에 경기, 경남, 부산, 충남 지역에서 채집한 병든 고추, 딸기, 오이와 토마토의 열매를 채집한 후 단포자를 분리하였다.
이론/모형
- 병원균에 대한 살균제의 효과를 검정하기 위해서 PDA배지에서 한천희석법으로 병원균의 균사생장 억제효과를 조사하였다. 실험에 사용한 살균제를 DMSO (Dimethyl sulfoxide, Junsei Chemical Co.
성능/효과
- B. cinerea 11-11, 11-24, 11-107, 11-8, 11-31, 11-100 등 6균주를 SHAM을 첨가하지 않은 PDA배지에 접종하여 azoxystrobin의 균사생장 억제효과를 구한 결과, 0.01 µg/ml의 azoxystrobin 처리구에서 억제 효과는 각각 18.3%, 17.9%, 18.8%, 11.4%, 9.8%, 63.2%이었으며, 0.1 µg/ml의 azoxystrobin 처리구에서는 각각 50.1%, 25.3%, 48.1%, 13.3%, 11.9%, 62.8%로 나타났다.
- SHAM을 처리하지 않거나 10 µg mL−1만 처리하였을 때에는 1 µg mL−1의 azoxystrobin의 효과가 각각 25.7과 27.5%에 지나지 않았지만,100 µg mL−1의 SHAM을 처리하면 병원균의 균사생장을 100% 억제하였다.
- 각 지역의 고추, 딸기, 오이와 토마토에서 분리한 101개의 B. cinerea 균주는 Fig. 4에서 보는 것과 같이 azoxystrobin에 대한 반응이 1.0 µg mL−1의 농도를 기준으로 감수성 반응과 저항성 반응으로 구분할 수 있었다.
- 하지만 저항성 균주로 판명되었던 11-74 균주는 100 µgmL−1의 처리에서 조차 세 가지 살균제 모두에서 30% 이하의 균사생장 억제효과를 보여 주었다. 결국 다양한 기주에서 분리한 잿빛곰팡이병균인 B. cinerea는 서로 다른 살균제이지만 동일한 strobilurin 계열에 속하는 살균제에 대해서 동일한 반응을 나타내는 교차 저항성을 보이고 있음을 알수 있었다.
- 그 결과 azoxystrobin에 대해서 감수성이었던 B. cinerea 11-20은 1.0 µg mL−1의 kresoximmethyl과 trifloxystrobin에서 균사의 생장이 100% 억제되었다.
- 5B). 기주별로는 딸기, 오이, 토마토에서 분리한 균주의 68.0, 40.0, 50.0%가 저항성 균주로 판명되었지만, 고추에서는 9.1%만이 저항성 균주로 나타났다(Fig. 5A). 물론 집단마다 균주의 수가 동일하지 않았기 때문에 집단 간 저항성 발현 정도를 비교하기에는 어려움이 있을 것으로 판단한다.
- 따라서 국내에서 채집한 B. cinerea 균주들은 azoxystrobin에 대한 반응을 가지고서 크게 감수성과 저항성의 두 개 집단으로 나눌 수 있었는데, 각 균주들의 EC50값을 계산하여 1.0 µg mL−1 이상이면 저항성, 1.0 µg mL−1 이하이면 감수성으로 구분하였다.
- 본 실험에서도 B.cinerea 11-54는 100 µg mL−1의 SHAM을 첨가하였을 때 배지상에서 azoxystrobin의 효과가 뚜렷하게 나타났다.
- 오이와 딸기 토마토 등에서 분리한 11-11을 비롯한 6개의 균주도 Fig. 3에서 보는 것처럼 100 µg mL−1의 SHAM을 배지에 첨가함으로써 azoxystrobin에 대한 감수성과 저항성 반응을 뚜렷하게 구별할 수 있었다.
- cinerea의 strobilurin계 살균제에 대한 저항성 발현 정도가 기주와 지역 간에 차이가 있음을 보여준다. 이 결과는 지역 간에, 그리고 기주 간에 처리하는 살균제의 종류가 다르며, 특히 충남지역과 딸기 재배지역에서 strobilurin계 살균제의 사용이 많은 것을 보여주는 결과라고 생각한다. 따라서 이런 지역에서의 strobilurin계 살균제의 효과적인 사용과 저항성 관리를 위해서는 살균제를 계획적이며 효율적으로 사용할 수 있어야 한다.
- 0 µg mL−1의 농도를 기준으로 감수성 반응과 저항성 반응으로 구분할 수 있었다. 전체 균주 중에서 감수성 균주의 비율은 46.5%이었으며, 저항성 균주는 53.5%를 차지하였다. 지역간 저항성 균주의 출현 비율은 경기, 경남, 부산에서 28.
- 5%를 차지하였다. 지역간 저항성 균주의 출현 비율은 경기, 경남, 부산에서 28.6, 41.9, 36.8%이었으며, 충남의 경우 81.1%로 다른 지역보다 높게 나타났다(Fig. 5B). 기주별로는 딸기, 오이, 토마토에서 분리한 균주의 68.
- 하지만 100 µg/ml의 SHAM을 azoxystrobin과 같이 첨가하였을 경우에는 0.1 µg/ml의 azoxystrobin 처리구에서 각각 91.0%, 100%, 100%, 0.0%, 8.9%, 13.6%로, 그 효과가 큰 차이를 보이며 감수성과 저항성 균주로 구분되었다(Fig. 3).
후속연구
- 따라서 포장에 전염원으로 남아있던 병원균은 살균제에 빈번하게 노출되고 저항성균이 나타나게 되었을 것으로 생각한다. 또한 strobilurin계에 속하는 동일한 계열의 살균제라고 할지라도 다른 상품명을 가진 다수의 품목이 포장에서 사용되고 있고,다른 작용 기작을 가지고 있는 살균제와 혼합제의 형태로 개발되어 지속적으로 포장에서 사용되고 있는 것도 저항성 유발의 한 요인이 될 것으로 생각한다. 이러한 현실에서 살균제를 사용하는 농민이 살균제의 계열과 작용기작에 대해서 자세히 알지 못하고 사용하게 된다면, 포장에서 살균제 저항성 발현의 위험도는 더욱 높아지며, 병원균마다 저항성 발현 가능성에 차이가 있을 지라도 계속적으로 strobilurin계 살균제 저항성균이 나타나게 될 것이라고 생각한다.
- 또한 strobilurin계에 속하는 동일한 계열의 살균제라고 할지라도 다른 상품명을 가진 다수의 품목이 포장에서 사용되고 있고,다른 작용 기작을 가지고 있는 살균제와 혼합제의 형태로 개발되어 지속적으로 포장에서 사용되고 있는 것도 저항성 유발의 한 요인이 될 것으로 생각한다. 이러한 현실에서 살균제를 사용하는 농민이 살균제의 계열과 작용기작에 대해서 자세히 알지 못하고 사용하게 된다면, 포장에서 살균제 저항성 발현의 위험도는 더욱 높아지며, 병원균마다 저항성 발현 가능성에 차이가 있을 지라도 계속적으로 strobilurin계 살균제 저항성균이 나타나게 될 것이라고 생각한다. 따라서 포장에서 살균제에 대해서 저항성을 보이는 병원균의 출현을 방지하기 위해서는 최소한 주요 작물을 대상으로 그 작물에 발생하는 다양한 병을 종합적으로 방제할 수 있는 하나의 방제체계 확립이 중요하다고 생각한다.
- 따라서 포장에서 살균제에 대해서 저항성을 보이는 병원균의 출현을 방지하기 위해서는 최소한 주요 작물을 대상으로 그 작물에 발생하는 다양한 병을 종합적으로 방제할 수 있는 하나의 방제체계 확립이 중요하다고 생각한다. 종합 방제체계가 확립된다면 살균제의 사용을 줄일 수 있을 뿐만 아니라 동일한 작용기작을 갖는 살균제의 사용을 자제할 수 있기 때문에 저항성 관리도 효율적으로 실시할 수 있을 것으로 생각한다.
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