2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride를 이용한 병원성 미생물 확인시험에 관한 연구 Study of 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride for Detection of Pathogenic Microorganisms원문보기
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)는 산화환원지시약으로 미생물의 증식에 의한 산소 소비를 쉽게 확인할 수 있다. 용해 후 무색의 형태를 띠고 있으나 생리활성이 있는 조직에서는 탈수소 효소(dehydrogenases)에 의해 환원되어 빨간색의 불용성 1,3,5,-triphenylformazan (TPF)가 된다. 본 연구에서는 병원성 미생물(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Candida albicans)에 TTC 지시약을 활용하여 미생물 성장시험에 대해 확인하였다. 시험 균주에 TTC를 첨가하여 확인한 결과, 모두 탈수소효소 반응으로 인한 TPF 형성으로 붉은색 콜로니를 관찰하였다. 이후 TTC 0.04% 이상의 농도 및 12 h 이상 배양조건으로 최적화 실험 후 균주별 CFU 값을 통해 TPF 발현능을 확인하였다. 결국 TTC가 병원성 세균 및 효모균 성장에 큰 영향을 끼치지 않으며 배양 시 세균의 경우 12 h, 효모균의 경우 48 h 이후부터 확인이 가능하였다. 이러한 결과들로부터 TTC를 활용한 미생물 성장 확인 시험법이 더 신속 정확한 방법으로 화장품 연구에 활용 가능할 것으로 사료된다.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)는 산화환원지시약으로 미생물의 증식에 의한 산소 소비를 쉽게 확인할 수 있다. 용해 후 무색의 형태를 띠고 있으나 생리활성이 있는 조직에서는 탈수소 효소(dehydrogenases)에 의해 환원되어 빨간색의 불용성 1,3,5,-triphenylformazan (TPF)가 된다. 본 연구에서는 병원성 미생물(Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Candida albicans)에 TTC 지시약을 활용하여 미생물 성장시험에 대해 확인하였다. 시험 균주에 TTC를 첨가하여 확인한 결과, 모두 탈수소효소 반응으로 인한 TPF 형성으로 붉은색 콜로니를 관찰하였다. 이후 TTC 0.04% 이상의 농도 및 12 h 이상 배양조건으로 최적화 실험 후 균주별 CFU 값을 통해 TPF 발현능을 확인하였다. 결국 TTC가 병원성 세균 및 효모균 성장에 큰 영향을 끼치지 않으며 배양 시 세균의 경우 12 h, 효모균의 경우 48 h 이후부터 확인이 가능하였다. 이러한 결과들로부터 TTC를 활용한 미생물 성장 확인 시험법이 더 신속 정확한 방법으로 화장품 연구에 활용 가능할 것으로 사료된다.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) is used as a redox indicator in culture media. It is colorless in the oxidized form and is reduced to formazan, an insoluble pigment, by dehydrogenases in actively growing microbial cells. The aim of this study was to assess by microbial test of the pathogen...
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) is used as a redox indicator in culture media. It is colorless in the oxidized form and is reduced to formazan, an insoluble pigment, by dehydrogenases in actively growing microbial cells. The aim of this study was to assess by microbial test of the pathogenic microorganisms using TTC reduction. The pathogenic microorganisms were reduced in medium by dehydrogenase to produce insoluble red formazan. We observed that the optimization method of TTC allowed more than 12 h incubation in 0.04% concentration. Also, the growth of microorganisms with media was increased formazan production. We confirmed that microorganisms were quickly observed to grow colonies cultured red color without affecting the growth of microorganisms. It is suggested that the microbial test using TTC can provide better and quicker test method in cosmetics development.
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) is used as a redox indicator in culture media. It is colorless in the oxidized form and is reduced to formazan, an insoluble pigment, by dehydrogenases in actively growing microbial cells. The aim of this study was to assess by microbial test of the pathogenic microorganisms using TTC reduction. The pathogenic microorganisms were reduced in medium by dehydrogenase to produce insoluble red formazan. We observed that the optimization method of TTC allowed more than 12 h incubation in 0.04% concentration. Also, the growth of microorganisms with media was increased formazan production. We confirmed that microorganisms were quickly observed to grow colonies cultured red color without affecting the growth of microorganisms. It is suggested that the microbial test using TTC can provide better and quicker test method in cosmetics development.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
TTC를 이용한 보다 신속하고 정확한 판정을 위해 TTC 농도 및 배양시간 등의 최적의 조건을 확인해 보았다. 0.
TTC의 환원력이 미생물 성장에 영향을 끼치는지를 확인해보았다. 총 5종의 균주의 CFU 측정한 결과, S.
본 연구를 통하여 TTC를 이용하여 병원성 미생물을 이용한 미생물 성장 확인시험법을 확인하였다. 병원성 미생물에 TTC를 첨가한 배지는 탈수소효소 반응으로 인한 TPF 형성으로 붉은색 콜로니를 관찰하였다.
또한 최근 식약처의 “화장품 안전기준 등에 관한 규정” 개정 고시(제2013-2호)에 따른 유통화장품의 미생물 검사 판정(통보) 등의 안전 관리 기준이 강화되고 있다. 본 연구에서는 관련 규정에 속한 병원성 미생물에 TTC를 적용시켜 미생물 검사 확인시험을 통해 기존보다 신속 정확한 안전성 확보의 가능성을 확인해 보았다.
제안 방법
TTC의 반응에 의한 TPF 형성 유무를 E. faecium을 이용하여 확인해 보았다. 고체 및 액체 배지를 이용하여 확인한 결과 E.
faecium을 이용하여 확인해 보았다. 고체 및 액체 배지를 이용하여 확인한 결과 E. faecium이 배양되면서 TTC의 탈수소 효소에 의한 TPF 반응으로 인해 붉은색 콜로니 형성을 관찰하였다(Figure 1). 이런 TTC 지시약은 배지에서 성장하는 균주를 쉽고 빠르게 확인할 수 있는 방법으로 보고되고 있다[9].
본 실험은 Kim 등에 의해 사용된 TTC 방법을 변형하여 사용하였다[8]. 미생물 시험에 사용되는 각각의 배지 조성 후 멸균시키고, 정해진 농도에 맞춰 첨가 후 사용하였으며 배지에 빛이 통과하지 못하게 봉한 후 배양기에서 배양하였다. 일정시간 배양 후 TTC에 의한 formazan 형성을 확인 후 490 nm 흡광도에서 측정하여 반응을 확인하였다.
본 연구를 통하여 TTC를 이용하여 병원성 미생물을 이용한 미생물 성장 확인시험법을 확인하였다. 병원성 미생물에 TTC를 첨가한 배지는 탈수소효소 반응으로 인한 TPF 형성으로 붉은색 콜로니를 관찰하였다. 이에 TTC 확인시험에서는 0.
본 실험은 Kim 등에 의해 사용된 TTC 방법을 변형하여 사용하였다[8]. 미생물 시험에 사용되는 각각의 배지 조성 후 멸균시키고, 정해진 농도에 맞춰 첨가 후 사용하였으며 배지에 빛이 통과하지 못하게 봉한 후 배양기에서 배양하였다.
이를 토대로 미생물 대수기 때 급격히 변화한 TTC 활성값을 통해 보다 신속한 판정을 내릴 수 있는 기준의 시간을 확립하였다. 이런 결과를 바탕으로 TTC를 이용한 탈수소효소생성 세균 계수를 ELISA로 측정하였다. 배지에서 성장하는 균주가 증가할수록 TTC 환원력에 의한 formazan 형성도 증가하였다(Figure 4).
즉 미생물 성장곡선의 변화가 TTC 활성과 관련 있는 것을 확인하였다. 이를 토대로 미생물 대수기 때 급격히 변화한 TTC 활성값을 통해 보다 신속한 판정을 내릴 수 있는 기준의 시간을 확립하였다. 이런 결과를 바탕으로 TTC를 이용한 탈수소효소생성 세균 계수를 ELISA로 측정하였다.
병원성 미생물에 TTC를 첨가한 배지는 탈수소효소 반응으로 인한 TPF 형성으로 붉은색 콜로니를 관찰하였다. 이에 TTC 확인시험에서는 0.04% 이상의 농도에서 12 h부터 TPF 형성을 관찰하였다. 또한, 균주별 CFU 값을 통해 TPF 발현능을 확인한 결과 유의적 관계가 있음을 확인하였다.
albicans 등의 병원성 미생물은 불검출이 되어야 한다[8]. 이에 TTC배지의 성능시험법을 활용하여 4종의 병원성 미생물의 검출 유무를 수행하였다. 그 결과 4개의 균주 모두 TPF 반응으로 인해 붉은색 콜로니를 형성함을 확인하였다(Figure 2).
미생물 시험에 사용되는 각각의 배지 조성 후 멸균시키고, 정해진 농도에 맞춰 첨가 후 사용하였으며 배지에 빛이 통과하지 못하게 봉한 후 배양기에서 배양하였다. 일정시간 배양 후 TTC에 의한 formazan 형성을 확인 후 490 nm 흡광도에서 측정하여 반응을 확인하였다.
화장품의 미생물한도 기준 및 시험방법 가이드라인을 근거로 하여 미생물 한도 시험을 실시하였다. 제품 1 g을 TSB에 9 mL에 첨가 후 충분히 교반한다.
균주는 세균에 그람 양성균 Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Enterococcus faecium (HB 2003)과 그람 음성균 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)와 Escherichia coli (ATCC 8739)를 이용하고 세균용 배지는 tryptic soy agar (TSA, Merck, USA)와 tryptic soy broth (TSB, Merck, USA)를 사용하였다. 진균에는 효모류인 Candida albicans (ATCC 10231)를 이용하였으며 배지는 potato dextrose agar (PDA, Merck, USA)와 potato dextrose broth (PDB, Merck, USA)를 사용하였다. 본 실험에 사용된 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (231121, BD, USA)는 Gibco inc.
성능/효과
TTC를 이용한 보다 신속하고 정확한 판정을 위해 TTC 농도 및 배양시간 등의 최적의 조건을 확인해 보았다. 0.04% 농도에서 TTC는 환원반응을 확인하였고 (Data not shown) 이를 기준으로 배양시간을 확인한 결과 12 h부터 환원력이 증가하는 것으로 나타났다(Figure 3). 즉 미생물 성장곡선의 변화가 TTC 활성과 관련 있는 것을 확인하였다.
이에 TTC배지의 성능시험법을 활용하여 4종의 병원성 미생물의 검출 유무를 수행하였다. 그 결과 4개의 균주 모두 TPF 반응으로 인해 붉은색 콜로니를 형성함을 확인하였다(Figure 2). 붉은색 콜로니 형성이 배지 내 미생물 생성 유무를 확인하는데 보다 정확한 판별이 가능할 것으로 사료된다.
albicans의 경우 48 h이 지났을 때부터 TTC의 환원력을 확인할 수 있었다. 다만, 최초 48 h이 지났을 때 배지에 성장된 미생물의 CFU 값이 약간의 차이가 발생하였지만 5일까지 경과했을 때는 CFU값이 거의 동일하게 확인되었다. 즉, TTC 환원에 의한 붉은색 콜로니 형성을 통해 미생물 오염 여부를 미리 확인할 수 있었으며, 이는 균주의 CFU 값에 영향을 끼치지 않았다.
04% 이상의 농도에서 12 h부터 TPF 형성을 관찰하였다. 또한, 균주별 CFU 값을 통해 TPF 발현능을 확인한 결과 유의적 관계가 있음을 확인하였다. 병원성 미생물을 활용하여 TTC가 미생물 성장에 영향을 끼치지 않으며 구체적으로 세균의 경우 12 h, 효모균의 경우 48 h 이후 배양 시 미생물 성장 확인이 가능하였다.
또한, 균주별 CFU 값을 통해 TPF 발현능을 확인한 결과 유의적 관계가 있음을 확인하였다. 병원성 미생물을 활용하여 TTC가 미생물 성장에 영향을 끼치지 않으며 구체적으로 세균의 경우 12 h, 효모균의 경우 48 h 이후 배양 시 미생물 성장 확인이 가능하였다. 이상의 결과를 바탕으로 미생물 한도시험법에 의한 48 h 이상의 배양 후 관찰 가능한 가이드라인을 TTC를 활용하면 미생물 성장 확인에 정확하고 신속한 판정이 가능할 것으로 사료되며, 이는 화장품 안전성 연구에 대한 다양한 방법적 접근이 될 것으로 기대된다.
또한 선행 연구에서도 Bredt에 의해 최대 107 CFU/mL까지 TTC 환원이 일어난다고 보고하였다[10]. 이에 TPF 발현이 미생물의 성장에 큰 영향을 끼치지 않는 것을 확인할 수 있었으며 세균의 경우 12 h 이후, 효모균의 경우 48 h 이후부터 TTC가 발현된 미생물 성장 확인이 가능하였다.
04% 농도에서 TTC는 환원반응을 확인하였고 (Data not shown) 이를 기준으로 배양시간을 확인한 결과 12 h부터 환원력이 증가하는 것으로 나타났다(Figure 3). 즉 미생물 성장곡선의 변화가 TTC 활성과 관련 있는 것을 확인하였다. 이를 토대로 미생물 대수기 때 급격히 변화한 TTC 활성값을 통해 보다 신속한 판정을 내릴 수 있는 기준의 시간을 확립하였다.
다만, 최초 48 h이 지났을 때 배지에 성장된 미생물의 CFU 값이 약간의 차이가 발생하였지만 5일까지 경과했을 때는 CFU값이 거의 동일하게 확인되었다. 즉, TTC 환원에 의한 붉은색 콜로니 형성을 통해 미생물 오염 여부를 미리 확인할 수 있었으며, 이는 균주의 CFU 값에 영향을 끼치지 않았다. 또한 선행 연구에서도 Bredt에 의해 최대 107 CFU/mL까지 TTC 환원이 일어난다고 보고하였다[10].
이런 TTC 지시약은 배지에서 성장하는 균주를 쉽고 빠르게 확인할 수 있는 방법으로 보고되고 있다[9]. 즉, TTC를 통해 화장품 미생물한도 시험방법에 적용시켜 제품 내 미생물에 대한 정확한 판정을 내릴 수 있는 가능성을 확인하였다.
TTC의 환원력이 미생물 성장에 영향을 끼치는지를 확인해보았다. 총 5종의 균주의 CFU 측정한 결과, S. aureus, P. aeruginosa, E. coli, E. faecium 등은 12 h부터 TTC의 발현을 확인하였다. 이때 배지에 성장된 미생물은 Non-TTC의 CFU 값이 거의 동일하게 확인되었다(Table 1).
후속연구
그 결과 4개의 균주 모두 TPF 반응으로 인해 붉은색 콜로니를 형성함을 확인하였다(Figure 2). 붉은색 콜로니 형성이 배지 내 미생물 생성 유무를 확인하는데 보다 정확한 판별이 가능할 것으로 사료된다.
병원성 미생물을 활용하여 TTC가 미생물 성장에 영향을 끼치지 않으며 구체적으로 세균의 경우 12 h, 효모균의 경우 48 h 이후 배양 시 미생물 성장 확인이 가능하였다. 이상의 결과를 바탕으로 미생물 한도시험법에 의한 48 h 이상의 배양 후 관찰 가능한 가이드라인을 TTC를 활용하면 미생물 성장 확인에 정확하고 신속한 판정이 가능할 것으로 사료되며, 이는 화장품 안전성 연구에 대한 다양한 방법적 접근이 될 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride를 이용해 미생물의 무엇을 확인할 수 있는가?
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)는 산화환원지시약으로 미생물의 증식에 의한 산소 소비를 쉽게 확인할 수 있다. 용해 후 무색의 형태를 띠고 있으나 생리활성이 있는 조직에서는 탈수소 효소(dehydrogenases)에 의해 환원되어 빨간색의 불용성 1,3,5,-triphenylformazan (TPF)가 된다.
미생물 시험 선택시 조건은 무엇인가?
미생물 시험은 신속 정확해야 하며 쉽게 반복할 수 있으며 시험비용이 비싸지 않아야 한다. 또한, 시험 샘플을 다양하게 다루기 위한 시료처리의 극대화도 필요하다.
colorimetric assay의 indicator는 무엇인가?
특히 colorimetric assay는 다양한 indicator들이 존재한다. Alamar blue, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulphophenyl)2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT), 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 등이 있다[1-2].
참고문헌 (10)
A. Mohammadzadeh, P. Farnia, K. Ghazvini, M. Behdani, T. Rashed, and J. Ghanaat, Rapid and low-cost colorimetric method using 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride for detection of multidrug- resistant Mycobacterium tuberculosis, J. Med. Microbiol., 55, 1657 (2006).
A. Klancnik, S. Piskernik, B. Jersek, and S. S. Mozina, Evaluation of dif fusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts, J. Microbiol. Meth., 81, 121 (2010).
P. Kumar and J. C. Tarafdar, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)as electron acceptor of culturable soil bacteria, fungi and actinomycetes, Biol. Fertil. Soils, 38, 186 (2003).
B. H. Nam, H. J. Jin, S. K. Kim, and Y. K. Hong, Quantitative viability ofseaweed tissues assessed with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, J. Applied Phycol., 10, 31 (1998).
J. Bederson, L. Pitts, S. Germano, M. Nishimura, R. Davis, and H. Bartkowski, Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats, Stroke, 17, 1304 (1986).
H. L. Brown, A. H. M. Vliet, R. P. Betts, and M. Reuter, Tetrazolium reduction allows assessment of biofilm formation by Campylobacter jejuni in a food matrix model, J. Appl. Microbiol., 115, 1212 (2013).
W. C. Chang, M. H. Chen, and T. M. Lee, 2,3,5-triphenyltetrazolium reduction in the viability assay of Ulva fasciata (chlorophyta) in response tosalinity stress, Bot. Bull. Acad. Sin., 40, 207 (1999).
S. Kim, M. J. Kim, H. Y. Kang, S. Y. Seol, D. T. Cho, and J. Kim, A simple colorimetric method for testing antimicrobial susceptibility of biofilmed bacteria, J. Microbiol., 48, 709 (2010).
T. Junillon and J. P. Flandrois, Diminution of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride toxicity on Listeria monocytogenes growth by iron source addition to the culture medium, Food Microbiol., 38, 1 (2014).
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.