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문제 정의
- 금속나노입자기반 방사선증감제는 세포의 방사선흡수선량을 증가시키는 효과 이외에 부가적으로 PIXE(particle induced X-ray emission), Auger electron 등의 저에너지 2차 방사선을 방출하여 더 효율적인 방사선증감효과를 나타낸다.[9,10,11] 따라서 본 연구에서는 합성된 방사선증감제의 방사선증감효과를 양성자 빔에 대해 실험하였다. 양성자빔 조사는 국립암센터의 MC50 싸이클로트론을 이용하여 40 MeV 양성자빔에 대해 실시하였다.
가설 설정
- U373MG cells were stained with Prussian blue. (a) U373MG cells only (b) U373MG cells incubated for 4 hours in the SPIONs treated medium.
제안 방법
- 본 연구에 사용된 금속나노입자 기반 방사선증감제는 덱스트란이 코팅된 산화철나노입자와 실리카가 코팅된 산화가돌리늄나노입자이다. 금속나노입자는 인체 세포에 직접 노출될 경우 세포 독성이 발현되므로 금속나노입자가 인체세포와 직접 접촉되는 것을 방지하기 위해 산화철에는 가교덱스트란을 코팅하였고, 산화가돌리늄나노입자에는 실리카를 코팅하였다.[4] 사용된 모든 화학약품은 추가적인 정화공정이 필요없는 고순도의 재료를 사용하였으며, 모든 용액의 제조에는 탈이온화공정(deionization proscess)을 통해 얻어진 2차 증류수를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 금속나노입자기반 방사선증감제는 리간드나 항체를 사용하지 않았으므로 오로지 농도차이에 의한 수동적 흡수만 일어난다. 따라서 뇌암세포인 U373MG (human glioblastoma cell line) 1x105 개를 12 well plate에 seeding한 후 배양액에 일정 농도의 합성된 금속나노입자를 희석하여 24시간동안 배양하였다. 배양 후 세포고정방법은 일반적인 세포실험방법을 따라 수행하였으며, 세포 내 축적도를 확인 및 양성자 빔 조사 전에 세포를 수차례 세척하여 세포 내로 흡수되지 않은 나노입자는 제거한 후 실험하였다.
- 이러한 실험조건은 국립암센터의 싸이클로트론 제어실에 설치된 싸이클로트론 구동 프로그램의 계산결과에 따라 결정하였다. 또한, 세포생존률을 계산함에 있어서 방사선조사 당시의 세포 수 차이에 따른 오차를 제거하고자 양성자 빔을 조사하기 전에 각 세포배양 샘플 내의 세포수를 측정하고 비교군(control group)의 집락 형성률 (plating efficiency)를 기준으로 각 샘플 내 세포 수에 대한 정규화 (normalization)된 측정값으로 세포 생존률을 판단하였다.
- 본 연구에서는 물리적 방사선증감제로서 금속나노입자인 산화철 나노입자와 산화가돌리늄나노입자를 합성하였고, 합성된 방사선증감제의 양성자 빔에 대한 방사선감수성 증가의 효과를 glioblastoma cell line을 이용하여 평가하였다. 방사선감수성 증감효과는 세포사멸의 주요 요인인 마이토콘드리아 손상 시 발현되는 Cytochrome C의 발현 양과 양성자 빔 조사선량에 따른 세포생존률을 측정하여 평가하였다. 금속나노입자 기반의 방사선증감제는 의료진단에 사용되는 X선에 대한 감쇄계수가 연조직에 비해 매우 크고 자성강도가 매우 세기 때문에 CT나 MRI에서 조영제의 역할도 할 수 있으므로 진단과 치료가 모두 가능한 theragnostics에 활용될 수도 있다.
- 또한, 방사선에 의한 세포사멸 작용에 의한 치사선량율의 감소인지 확인하기 위하여 양성자 빔에 조사된 세포의 단백질을 추출하여 방사선 치사의 biomarker인 cytochrom c의 발현량을 Western Blot Assay를 이용하여 분석하였다. 방사선증감비 측정 시에 합성된 방사선증감제 자체의 독성효과가 기여할 수도 있으므로 증감제투여 농도를 MTT assay결과 독성이 나타나지 않는 일정 농도로만 투여하였다. 실험에 사용한 방사선증감제의 농도는 SPIONs의 경우 100 μg/ml 였으며, SPGONs의 농도는 50 μg/ml 였다.
- 따라서 뇌암세포인 U373MG (human glioblastoma cell line) 1x105 개를 12 well plate에 seeding한 후 배양액에 일정 농도의 합성된 금속나노입자를 희석하여 24시간동안 배양하였다. 배양 후 세포고정방법은 일반적인 세포실험방법을 따라 수행하였으며, 세포 내 축적도를 확인 및 양성자 빔 조사 전에 세포를 수차례 세척하여 세포 내로 흡수되지 않은 나노입자는 제거한 후 실험하였다.
- 본 연구에서는 물리적 방사선증감제로서 금속나노입자인 산화철 나노입자와 산화가돌리늄나노입자를 합성하였고, 합성된 방사선증감제의 양성자 빔에 대한 방사선감수성 증가의 효과를 glioblastoma cell line을 이용하여 평가하였다. 방사선감수성 증감효과는 세포사멸의 주요 요인인 마이토콘드리아 손상 시 발현되는 Cytochrome C의 발현 양과 양성자 빔 조사선량에 따른 세포생존률을 측정하여 평가하였다.
- 산화철나노입자의 세포 내 축적도 평가를 위해서는 철이온에 대한 상용의 염색법과 염색시약인 Prussian Blue를 이용해서 세포 내에 축적된 산화철나노입자를 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였으나, 가돌리늄은 세포실험에서 사용되지 않는 시약이고 염색법이나 염색 시약이 존재하지 않기 때문에 유로퓸(europium)을 도핑하여 confocal laser scanning microscopy(CLSM)로 관찰하였다. 유로퓸은 CLSM 영상에서 레이저의 광자극에 의해 붉은 색의 발광을 하므로 세포 내에 축적된 유로퓸이 도핑된 산화가돌리늄은 붉은 색으로 확인이 가능하다.
- 실리카코팅 SPGONs의 경우 가돌리늄을 광학현미경으로 관찰할 수 있는 염색시약이 없으므로 SPGONs 합성 시에 유로퓸을 도핑하여 CLSM으로 세포 내 축적도를 평가하였다. 유로퓸은 레이저 광자극에 의해 붉은 색 발광을 하므로 CLSM으로 확인이 가능하다.
- 암세포에 각각의 방사선증감제를 흡수시킨 후 양성자 빔을 조사한 후 각 그룹 별로 단백질을 추출하여 Western blotting으로 Cytochrome C의 발현량을 분석하였다. Cytochrome C는 마이토콘리이아 손상에 의해 세포사멸이 발생할 때 발현되는 단백질로서 방사선에 의한 세포사멸의 biomarker이다.
- 양성자빔 조사는 국립암센터의 MC50 싸이클로트론을 이용하여 40 MeV 양성자빔에 대해 실시하였다. 양성자빔의 에너지에 따른 브래그피크의 깊이가 세포의 위치가 될 수 있도록 배치하였으며, 세포에 조사 전에 필름선량계를 이용하여 흡수선량을 측정한 후 세포에 조사하였다. 이러한 실험조건은 국립암센터의 싸이클로트론 제어실에 설치된 싸이클로트론 구동 프로그램의 계산결과에 따라 결정하였다.
- 합성된 방사선증감제의 암세포 내 축적도를 평가하기 위하여 Prussian Blue로 세포 내 SPIONs를 염색한 후 광학현미경으로 관찰한 영상과 CLSM으로 세포 내 SPGONs를 관찰한 영상을 Fig. 2와 Fig. 3에 나타내었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 금속나노입자 기반 방사선증감제는 덱스트란이 코팅된 산화철나노입자와 실리카가 코팅된 산화가돌리늄나노입자이다. 금속나노입자는 인체 세포에 직접 노출될 경우 세포 독성이 발현되므로 금속나노입자가 인체세포와 직접 접촉되는 것을 방지하기 위해 산화철에는 가교덱스트란을 코팅하였고, 산화가돌리늄나노입자에는 실리카를 코팅하였다.
이론/모형
- 가교덱스트란(crosslinked dextran)이 코팅된 산화철나노입자는 공침법을 이용하여 합성하였다.[5] 우선, 0.
- 또한, 방사선에 의한 세포사멸 작용에 의한 치사선량율의 감소인지 확인하기 위하여 양성자 빔에 조사된 세포의 단백질을 추출하여 방사선 치사의 biomarker인 cytochrom c의 발현량을 Western Blot Assay를 이용하여 분석하였다. 방사선증감비 측정 시에 합성된 방사선증감제 자체의 독성효과가 기여할 수도 있으므로 증감제투여 농도를 MTT assay결과 독성이 나타나지 않는 일정 농도로만 투여하였다.
- 비교군과 각각의 방사선증감제를 흡수한 암세포 그룹의 양성자 빔 흡수선량에 대한 세포생존률 측정은 clonogenic assay를 통해 측정하였으며 측정된 결과는 아래 Table 1과 같다.
- 산화가돌리늄나노입자는 요소와 1-프로판올을 이용한 수열합성법을 이용하여 합성하였다. 0.
- [9,10,11] 따라서 본 연구에서는 합성된 방사선증감제의 방사선증감효과를 양성자 빔에 대해 실험하였다. 양성자빔 조사는 국립암센터의 MC50 싸이클로트론을 이용하여 40 MeV 양성자빔에 대해 실시하였다. 양성자빔의 에너지에 따른 브래그피크의 깊이가 세포의 위치가 될 수 있도록 배치하였으며, 세포에 조사 전에 필름선량계를 이용하여 흡수선량을 측정한 후 세포에 조사하였다.
- 양성자빔의 에너지에 따른 브래그피크의 깊이가 세포의 위치가 될 수 있도록 배치하였으며, 세포에 조사 전에 필름선량계를 이용하여 흡수선량을 측정한 후 세포에 조사하였다. 이러한 실험조건은 국립암센터의 싸이클로트론 제어실에 설치된 싸이클로트론 구동 프로그램의 계산결과에 따라 결정하였다. 또한, 세포생존률을 계산함에 있어서 방사선조사 당시의 세포 수 차이에 따른 오차를 제거하고자 양성자 빔을 조사하기 전에 각 세포배양 샘플 내의 세포수를 측정하고 비교군(control group)의 집락 형성률 (plating efficiency)를 기준으로 각 샘플 내 세포 수에 대한 정규화 (normalization)된 측정값으로 세포 생존률을 판단하였다.
성능/효과
- 40 MeV 양성자 빔을 조사해서 측정된 세포생존곡선에서 계산된 방사선증감비와 Western blotting을 이용해서 측정된 Cytochrom C의 발현량 측정에서 구해진 방사선 조사에 의한 세포사멸(apoptosis)량을 비교해보면 SPIONs가 SPGONs보다 방사선증감효과가 더 큰 것으로 나타났다. 하지만, 방사선물리학적인 관점에서 보면 SPIONs보다 SPGONs에서의 방사선증감효과가 더 커야한다.
- 5에서 보이는 바와 같이 띠의 색짙기를 비교할때, 비교군보다 SPGONs를 흡수한 그룹에서 약간 더많은 양의 Cytochrome C가 관찰되며, SPIONs를 흡수한 그룹에서는 비교군보다 상당히 많은 양의 Cytochrome C가 관찰되므로 합성된 SPGONs와 SPIONs 모두 방사선증감효과는 있지만 SPIONs의 방사선증감효과가 훨씬 더 크다는 것을 알 수 있다. Cytochrome C의 발현량으로 확인한 SPGONs와 SPIONs의 방사선증감효과에 대한 결과는 세포생존곡선을 통해 얻어진 90 % 세포사멸에 필요한 흡수선량 감소의 결과와 정성적으로 일치한다. 따라서 합성된 SPIONs와 SPGONs는 방사선증감제 기능을 한다는 것이 충분히 검증되었다.
- Fig. 5에서 보이는 바와 같이 띠의 색짙기를 비교할때, 비교군보다 SPGONs를 흡수한 그룹에서 약간 더많은 양의 Cytochrome C가 관찰되며, SPIONs를 흡수한 그룹에서는 비교군보다 상당히 많은 양의 Cytochrome C가 관찰되므로 합성된 SPGONs와 SPIONs 모두 방사선증감효과는 있지만 SPIONs의 방사선증감효과가 훨씬 더 크다는 것을 알 수 있다. Cytochrome C의 발현량으로 확인한 SPGONs와 SPIONs의 방사선증감효과에 대한 결과는 세포생존곡선을 통해 얻어진 90 % 세포사멸에 필요한 흡수선량 감소의 결과와 정성적으로 일치한다.
- 금속나노입자의 세포 내 흡수는 입자의 크기에 따라 많이 달라질 수 있다.[4] TEM으로 측정된 금속 나노입자의 평균 지름이 SPIONs는 약 3.5 nm, SPGONs는 약 70nm 이므로, SPIONs에 비해 SPGONs 의 크기가 부피단위로 약 8000 배 크기 때문에 세포 내 흡수에 있어서도 유의할 만한 차이가 있었을 것을 판단된다. 마지막으로, 코팅 물질의 차이에 의해서 SPIONs와 SPGONs의 세포 내 흡수가 달랐기 때문이다.
- Cytochrome C의 발현량으로 확인한 SPGONs와 SPIONs의 방사선증감효과에 대한 결과는 세포생존곡선을 통해 얻어진 90 % 세포사멸에 필요한 흡수선량 감소의 결과와 정성적으로 일치한다. 따라서 합성된 SPIONs와 SPGONs는 방사선증감제 기능을 한다는 것이 충분히 검증되었다.
- 2의 (b)에 보인 바와 같이 세포질 내에 흡수된 SPIONs가 Prussian Blue에 의해 푸른 색으로 염색되어 있음을 알 수 있다. 따라서 합성된 가교덱스트란코팅 SPIONs는 세포 내로 잘 흡수되어 세포질 내에 축적됨을 확인하였다.
- 4에서 볼 수 있듯이 방사선흡수선량 증가에 따른 세포생존률은 방사선증감제를 흡수하지 않은 비교군에 비해 SPIONs를 흡수한 암세포와 SPGONs를 흡수한 암세포에서 유의하게 감소함을 알 수 있다. 따라서 합성된 금속나노입자들은 방사선증감 효과가 있다고 판단되며, 방사선증감비는 SPIONs가 SPGONs보다 더 크게 나타났다.
- 또한, 합성된 나노입자의 평균 직경이 산화철나노입자는 약 3.5 nm이고 산화가돌리늄은 약 70 nm이므로 나노입자 하나당 필요한 산화철분자의 개수와 산화가돌리늄의 개수비를 각 분자의 크기가 같다는 가정 하에 구해보면 대략 43 : 343000이 되는데, 산화철의 분자량이 232 amu 이고, 산화가돌리늄의 분자량이 362 amu이므로 100 μg 과 50 μg 내에 존재하는 산화철 분자와 산화가돌리늄 분자의 비는 0.431 : 0.138 이므로 1 ml 당 산화철나노입자와 산화가 돌리늄나노입자의 개수 비는 0.431/43 : 0.138/343000이므로 대략 25,000 : 1의 비로 SPIONs 입자농도가 SPGONs 입자농도보다 훨씬 더 크다는 것을 알 수 있다.
- 본 연구에서 개발된 물리적 방사선증감제는 양성자빔 조사 후 측정된 세포생존곡선 분석 결과와 마이토콘드리아 손상 시 발현되는 방사선 세포사멸의 바이오마커인 Cytochrome C의 발현량 분석에서 얻어진 결과와 일치하게 암세포에 대해 방사선증감효과가 있음을 보였다. 현재 사용되고 있는 화학적 방사선증감제는 주로 산소효과를 증가시켜 방사선증감작용을 유발하는데 비해 개발된 물리적 방사선증감제는 암세포의 유효원자번호 자체를 증가시키고 2차 방사선을 발생하여 세포 내에서 방사선과 세포의 직접작용을 증가시킴으로서 방사선증감효과를 유발하는 획기적인 방사선증감제로서의 가능성이 매우 높다고 판단된다.
- 그럼에도 불구하고 실험결과가 물리학적 이론과 상반되는 이유는 다음과 같다. 첫째, 본 연구에 사용된 금속나노입자 기반의 방사선증감제는 리간드나 항체를 사용하지 않았으므로 오로지 농도차이에 의한 수동적 흡수만 일어날 것이라고 판단된다.[14] 그런데 세포를 배양하는 배양액 내에 희석시킨 방사선증감제에 의한 영향을 배제하기 위해 MTT 독성이 나타나지 않는 농도로 처리했으므로 배양액 내의 금속나노입자 농도가 달랐기 때문에 세포 내 금속 나노입자의 축적도가 달라서 방사선증감비가 달라졌을 것으로 판단된다.
후속연구
- SPIONs에 코팅된 덱스트란은 세포 대사에 필요물질이므로 SPGONs에 코팅된 실리카보다 세포 내 흡수가 더 많이 일어난다.[14] 따라서, 향후 SPGONs의 직경을 SPIONs 정도로 조절할 수 있는 합성법을 개발하고 금속나노입자의 표면에 리간드나 항체 등과 같은 암세포 표적분자를 결합시킨다면 현재 개발된 물리적 방사선증감제는 방사선치료효과를 획기적으로 개선할 수 있을 것으로 판단된다.
- 치료가능비란 종양세포의 방사선감수성과 정상세포의 방사선감수성의 비를 말하는 것으로서 종양세포의 방사선감수성이 정상세포의 방사선감수성보다 더 커야만 방사선에 피폭된 정상조직은 살아남고 종양조직은 사멸될 수 있다. 만약, 정상세포의 방사선감수성이 암세포의 방사선감수성보다 높은 경우에 방사선치료를 시행한다면 정상조직은 모두 사멸되고 암세포만 살아남는 아이러니한 결과를 얻게 될 것이다. 방사선감수성은 종양세포의 종류에 따라 다르며, glioblastoma와 같은 특정 암세포는 방사선감수성이 매우 낮다.
- 현재 사용되고 있는 화학적 방사선증감제는 주로 산소효과를 증가시켜 방사선증감작용을 유발하는데 비해 개발된 물리적 방사선증감제는 암세포의 유효원자번호 자체를 증가시키고 2차 방사선을 발생하여 세포 내에서 방사선과 세포의 직접작용을 증가시킴으로서 방사선증감효과를 유발하는 획기적인 방사선증감제로서의 가능성이 매우 높다고 판단된다. 하지만, 금속나노입자의 인체 내 대사 등에 대한 추가적인 연구가 이루어져야 할 것이다.
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