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문제 정의
- 육미지황탕(YM)이 자유라디칼을 소거하는 능력이 있는지 확인하고자 DPPH assay를 시행하였다. 각각의 다른 농도의 YM을 DPPH와 섞은 후 상온에서 30분간 반응시켰다.
- 이에 본 연구에서는 보음제인 육미지황탕을 이용하여 피부 노화 억제와 관련된 인자들에 미치는 변화를 생화학적 및 분자생물학적으로 관찰하여 광노화 피부 억제와 관련된 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 과학적으로 검증하고자 하였다.
제안 방법
- β-actin을 internal control로 사용하여 IL-1β, TNF-α, human MMP-9, MMP-3의 발현을 상대적으로 평가하였다.
- 25 % Triton X-100에 30분 동안 두 번 담가 SDS를 제거하였다. 3차 증류수로 씻은 후 0.1% (w/v) Coomassie blue R-250 용액에서 30분 간 염색하여 관찰하였다.
- HaCaT cell은 다양한 농도의 YM으로 1시간 동안 선처리 하였다. 60 mJ/㎠의 강도로 UVB를 조사하여 24시간 동안 배양한 후 배양액을 전기영동하였다. UVB는 MMP-9의 분비는 자극하였으나 MMP-2에는 영향을 미치지는 않았다.
- YM을 농도별로 선 처리(0, 10, 50, 100, 500 ㎍/㎖)한 후 2시간 동안 배양하였고, H2O2와 DCFH-DA를 각각 1 mM, 10 μM의 농도로 20분 동안 처리한 후 형광도를 측정하였다. DCF 형광도는 excitation 485 ㎚, emission 530 ㎚의 파장에서 Wallac 1420 VICTOR3 multilabel counter (PerkinElmer Life Science, Turku, Finland)로 측정하였다.
- HaCaT cell 내 ROS의 생성은 형광표지자인 2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 육미지황탕(YM)이 UVB에 의하여 증가된 세포내 ROS에 미치는 영향을 관찰하고자 DCFH-DA assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 60 mJ/㎠의 강도로 UVB를 조사하여 12시간을 방치한 후 YM을 농도별로 처리함과 아울러 DCFH-DA 시약을 처리하고, 5분 후 형광 흡광도를 측정하였다. Fig.
- HaCaT 세포주를 3×105/well에 준비한 후 YM 100, 500, 1000 ㎍/㎖을 선처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- MMP-9의 분비를 측정하기 위하여 substrate gel zymography를 시행하였다25). HaCaT 세포를 3×105 cell/㎖ 의 농도로 분주하였다.
- Mosmann20)이 보고한 방법에 따라 살아있는 세포의 효소활성으로 인한 tetrazolium dye인 MTT를 자줏빛의 불용해성 포르마잔으로 환원하는 원리를 이용한 MTT assay를 통하여 육미지황탕(YM)이 HaCaT 세포의 생존에 미치는 효과를 측정하였다. HaCaT 세포를 96-well plate에 well 당 1×105 cells 밀도로 분주한 후 농도별로 YM을 처리하여 37 ℃, 5 % CO2, 습도 100 % 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다.
- 각각의 cycle은 95℃에서 30초 동안 denaturation, 62 ℃(TNF-α: 59 ℃)에서 30 초 동안 annealing, 72 ℃에서 40 초 동안 extension시켰다. PCR product는 1 % agarose gel에서 전기영동 하였고, ethidium bromide로 염색을 한 후 Gel Doc(Bio-Rad, USA)을 사용하여 관찰하였다. β-actin을 internal control로 사용하여 IL-1β, TNF-α, human MMP-9, MMP-3의 발현을 상대적으로 평가하였다.
- PCR 증폭을 하기 위하여 TaqPCRxDNA polymerase, Recombinant (Invitrogen) 을 사용하였고, 반응조건은 다음과 같이 하였다. 95℃에서 5분간 초기 denaturation 시킨 후 30 cycle을 증폭시켰다.
- Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
- YM을 농도별로 선 처리(0, 10, 50, 100, 500 ㎍/㎖)한 후 2시간 동안 배양하였고, H2O2와 DCFH-DA를 각각 1 mM, 10 μM의 농도로 20분 동안 처리한 후 형광도를 측정하였다.
- 7B). YM이 MMP-9의 활성을 직접적으로 억제하는지 관찰하고자 UVB를 조사한 HaCaT 세포의 배양액을 가지고 in vitro zymography를 시행하였다. 그 결과 MMP-9의 활성은 직접적으로 YM에 의하여 감소되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 각 lane에 따라 gel을 자른 후 각각 다른 농도의 YM이 함유된 탱크에 놓고 50 mM Tris–HCl(pH 7.6), 20 mM NaCl, 5 mM CaCl2, and 0.02% Brij-58이 함유된 digestion buffer에서 20시간 동안 37℃에서 배양한 후 염색하여 관찰하였다.
- 양성 대조군으로는 BHT(butylated hydroxytoluene, Sigma, USA)를 양성대조군으로 사용하였으며, DPPH radical을 50% 소거시키는 시료의 농도를 IC50 으로 하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 4회 반복하여 측정하였다. 환원능은 다음과 같이 계산하였다.
- 5 ㎎/㎖)용액 50 ㎕/㎖를 각 well에 넣고 3 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 배양액을 버리고 0.01N HCl로 만든 10% SDS를 100 ㎕/well씩 넣어 MTT-formazan crystal을 용해한 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 살아있는 세포의 백분율은 미처리 세포를 기준으로 계산하였고, 모든 실험은 3번 반복하였다.
- 또한 MMP-9의 활성을 측정하고자 in vitro gelatinase inhibition assay를 시행하였다. UVB로 자극한 HaCaT 세포를 키운 배지를 sample buffer에 섞고, 전기영동을 시행한 후 위와 동일한 방법으로 gel을 0.
- HaCaT 세포를 3×105 cells/well에 준비한 후 YM 100, 500, 1000 ㎍/㎖을 선 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 UVB를 60 mJ/㎠로 조사하고 15분 후에 각 well에 lysis buffer를 넣고 IKA homogenizer(ULTRA-TURRAX)를 이용하여 lysis시켰다. Assay buffer로 lysis한 HaCaT cell lysate내 XO 함량을 측정하기 위해 xanthine oxidase activity assay kit (BioVision lnc.
- 보음제로서 항산화, 아토피피부염 관련 제반 증상 완화 및 면역조절을 통한 항염증 효과 등에 효과가 있다고 보고된 육미지황탕의 광노화 억제효과를 관찰하기 위하여 피부노화 억제와 관련된 인자들에 미치는 변화를 HaCaT cell을 이용하여 생화학적 및 분자생물학적으로 관찰함으로써 광노화 피부 억제와 관련된 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 과학적으로 검증한 바 다음과 같은 결과를 얻었다.
- , Axiovert 25C, Germany)를 이용하여 관찰하였다. 분자생물학적 실험을 위하여 Wallac 1420 VICTOR3 multilabel counter(PerkinElmer Life Science, Turku, Finland), Ultra-Turrax (T10 basic, (주)엘케이 랩코리아), Vacuum drying oven(국제 싸이엔, Korea) 및 Microplate reader(Molecular Device, VERSAmax, Sunnyville, CA, USA) 등을 이용하였다.
- 01N HCl로 만든 10% SDS를 100 ㎕/well씩 넣어 MTT-formazan crystal을 용해한 후 microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 살아있는 세포의 백분율은 미처리 세포를 기준으로 계산하였고, 모든 실험은 3번 반복하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 육미지황탕 추출액의 농축을 위하여 rotary vacuum evaporator (NE2001형, EYELA, Japan)를 이용하였고, 피부 자외선 조사를 위하여 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)와 UV light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)를 이용하였다. 세포배양 관련 실험을 위하여 CO2 incubator(SHEL LAB, Korea)와 inverted microscope(Carl Zeiss Inc., Axiovert 25C, Germany)를 이용하여 관찰하였다. 분자생물학적 실험을 위하여 Wallac 1420 VICTOR3 multilabel counter(PerkinElmer Life Science, Turku, Finland), Ultra-Turrax (T10 basic, (주)엘케이 랩코리아), Vacuum drying oven(국제 싸이엔, Korea) 및 Microplate reader(Molecular Device, VERSAmax, Sunnyville, CA, USA) 등을 이용하였다.
- 세포배양 실험의 자외선 조사는 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)에서 조사한 광원을 UV Light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)로 측정한 후 UVB 강도(intensity)가 0.3 ㎽/㎠가 되는 높이에서 3×105 cells/㎖의 농도로 DMEM medium에 부유시켜 6 well plate에 분주한 후 YM을 실험의 종류에 따라 농도별로 선 처리(0.01, 0.1, 0.5, 1 ㎎/㎖)한 후 24시간 동안 배양한 후 60 mJ/㎠를 1회 조사하였다.
- 실험방법은 96 well microplate에 육미지황탕 10 ㎕를 넣고 DPPH solution 190 ㎕를 가한 후 실온에서 30분간 반응시켜 각 반응액의 흡광도를 517 nm에서 측정하였다. 양성 대조군으로는 BHT(butylated hydroxytoluene, Sigma, USA)를 양성대조군으로 사용하였으며, DPPH radical을 50% 소거시키는 시료의 농도를 IC50 으로 하였다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 4회 반복하여 측정하였다.
- 실험에 사용한 육미지황탕의 처방 내용은 다음과 같다(Table 1). 육미지황탕 10첩 분량(458 g)을 둥근 플라스크에 넣고 증류수 4L를 넣은 후 약 3시간 전탕하여 여액을 rotary vacuum evaporator (NE2001형, EYELA, Japan)로 감압 농축하여 육미지황탕 추출물(YM) 182 g을 회수하였다. 회수한 YM을 95% EtOH, 85% EtOH, 75% EtOH로 다시 추출하여 여과하였다.
- 7A). 육미지황탕(YM)의 HaCaT cell에서의 MMP-9의 분비에 대한 효능을 관찰하고자 gelatin zymographic assay를 시행하였다. HaCaT cell은 다양한 농도의 YM으로 1시간 동안 선처리 하였다.
- 육미지황탕(YM)이 UVB에 의하여 증가된 세포내 ROS에 미치는 영향을 관찰하고자 DCFH-DA assay를 시행하였다. HaCaT 세포에 60 mJ/㎠의 강도로 UVB를 조사하여 12시간을 방치한 후 YM을 농도별로 처리함과 아울러 DCFH-DA 시약을 처리하고, 5분 후 형광 흡광도를 측정하였다.
- 육미지황탕의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거능에 의하여 관찰하였다. DPPH 라디칼은 짙은 자색을 띠는 비교적 안정한 라디칼로서 항산화 성분에 의해 환원되면 짙은 자색이 탈색되어지는데, 특히 토코페롤, 아스코르빈산 및 방향족 아민류 등에 의해 환원력이 큰 것으로 알려졌다34).
- HaCaT 세포에 다양한 농도의 육미지황탕을 2시간 선 처리하고, UVB로 자극한 후 24시간 배양하였다. 전체 RNA를 세포에서 추출하였고, 염증 및 주름과 연관된 유전자의 발현은 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. Fig.
대상 데이터
- Human keratinocyte(HaCaT cells)는 CLS (Cell Lines Service)로부터 분양을 받아 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)(Hyclone; Logan, UT, USA)에 10% FBS, 100U/㎖ penicillin과 100 ㎍/㎖ streptomycin (Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 육미지황탕 추출액의 농축을 위하여 rotary vacuum evaporator (NE2001형, EYELA, Japan)를 이용하였고, 피부 자외선 조사를 위하여 20W Ultraviolet B(UVB) lamp(Sankyo G20T10E, 20W, Japan)와 UV light meter(UV-340, UVA+UVB, Lutron, Taiwan)를 이용하였다. 세포배양 관련 실험을 위하여 CO2 incubator(SHEL LAB, Korea)와 inverted microscope(Carl Zeiss Inc.
- 본 실험에 사용한 시약은 세포배양을 위하여 fetal bovine serum(FBS)과 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 등을 이용하였고, 항산화 관련 실험을 위하여 xanthine oxidase activity assay kit(BioVision lnc, CA, USA), superoxide dismutase assay kit 및 catalase assay kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI)를 이용하였다.
- )를 사용하였으며, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. 사용한 표준물질은 CAT formaldehyde를 사용하였다. 96 well에 assay buffer(100 mM potassium phosphate, pH 7.
- , CA, USA)를 사용하였으며, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. 사용한 표준물질은 hydrogen peroxide(H2O2)를 사용하였다. Standard는 3차 증류수로 희석하여 0.
- 육미지황탕의 처방구성은 방약합편19)에 준하였으며, 약재는 삼홍건재약업사(경동시장)에서 국산(제품)만을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 육미지황탕의 처방 내용은 다음과 같다(Table 1).
데이터처리
- 각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검증(paired t-test)을 실시하였고, 통계적 유의수준은 p<0.05로 실시하였다.
- 통계적 분석은 SPSS 12.0 for windows(SPSS Inc., USA)를 이용하여 평균과 표준편차를 산출하였으며, 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 적용하였다. 각 군간 차이를 검증하기 위하여 t 검증(paired t-test)을 실시하였고, 통계적 유의수준은 p<0.
이론/모형
- 배양 후 UVB를 60 mJ/㎠로 조사하고 15분 후에 각 well에 lysis buffer를 넣고 IKA homogenizer(ULTRA-TURRAX)를 이용하여 lysis시켰다. 20 mM HEPES buffer(pH 7.2, containing 1 mM EGTA, 210 mM mannitol, and 70 mM sucrose)로 lysis한 HaCaT cell lysate 내 SOD 활성을 측정하기 위해 superoxide dismutase assay kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI.)를 사용하였으며, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였으며, 사용한 표준물질은 bovine erythrocyte SOD(Cu/Zn)를 사용하였다. SOD 활성측정은 96 well plate에 빛을 차광시킨 200㎕의 radical detector를 넣고 각 well에 standard 용액 또는 HaCaT cell lysate 10 ㎕를 넣었다.
- 배양 후 UVB를 60 mJ/㎠로 조사하고 15분 후에 각 well에 lysis buffer를 넣고 IKA homogenizer(ULTRA-TURRAX)를 이용하여 lysis시켰다. Assay buffer로 lysis한 HaCaT cell lysate내 XO 함량을 측정하기 위해 xanthine oxidase activity assay kit (BioVision lnc., CA, USA)를 사용하였으며, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. 사용한 표준물질은 hydrogen peroxide(H2O2)를 사용하였다.
- CAT활성도는 Johanson and Borg23)의 방법에 따라 HaCaT cells을 이용하여 수행하였다. HaCaT 세포주를 3×105/well에 준비한 후 YM 100, 500, 1000 ㎍/㎖을 선처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 0, containing 1 mM EDTA)]를 넣고 IKA homogenizer (ULTRA-TURRAX)를 이용하여 lysis시켰다. HaCaT cell lysate 내 CAT 활성을 측정하기 위해 CAT assay kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI.)를 사용하였으며, 사용방법은 제조회사의 지시에 따라 시행하였다. 사용한 표준물질은 CAT formaldehyde를 사용하였다.
- SOD 함량은 Maier and Chan22)의 방법)에 따라 HaCaT cells을 이용하여 수행하였다. HaCaT 세포주를 3×105 cells/well에 준비한 후 YM 100, 500, 1000 ㎍/㎖을 선 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- Total RNA는 Trizol reagent(Invitrogen)를 이용하였으며 제조회사의 방법에 준하였다. Spectrophotometer를 이용하여 RNA의 농도를 측량한 후 M-MLV reverse transcriptase(Promega, Madison, WI, USA)에 의하여 cDNA를 합성하였고, specific primer 들을 이용한 PCR방법을 통하여 cDNA를 증폭하였다.
- XO의 생성량은 Bergmeyer 등21)의 방법)에 따라 HaCaT cells(human keratinocytes)을 이용하여 수행하였다. HaCaT 세포를 3×105 cells/well에 준비한 후 YM 100, 500, 1000 ㎍/㎖을 선 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 육미지황탕의 항산화 활성은 Wang과 Zhang24)의 DPPH 법을 이용하여 측정하였다. 실험방법은 96 well microplate에 육미지황탕 10 ㎕를 넣고 DPPH solution 190 ㎕를 가한 후 실온에서 30분간 반응시켜 각 반응액의 흡광도를 517 nm에서 측정하였다.
성능/효과
- DPPH 라디칼은 짙은 자색을 띠는 비교적 안정한 라디칼로서 항산화 성분에 의해 환원되면 짙은 자색이 탈색되어지는데, 특히 토코페롤, 아스코르빈산 및 방향족 아민류 등에 의해 환원력이 큰 것으로 알려졌다34). DPPH 시약에 대해 YM을 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 10-500㎍/㎖ 농도에서 진보라색을 탈색시켜 YM의 농도가 증가함에 따라 자유라디칼을 소거하는 활성도가 증가함을 관찰하였다. 또한 농도의존적으로 더욱 높은 활성을 보여 육미지황탕에는 항산화 활성을 갖는 유용한 성분들이 함유되어 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 육미지황탕의 항산화 활성은 세포내에서 염증발현시 증가되는 산화적 스트레스에 대해 효과적으로 방어할 것으로 사료되었다.
- 각각의 다른 농도의 YM을 DPPH와 섞은 후 상온에서 30분간 반응시켰다. Fig. 5.에서 보는 바와 같이 500 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 큰 차이가 없었으나, YM의 농도가 증가함에 따라 자유라디칼을 소거하는 활성도가 증가함을 관찰하였다. 활성도의 증가는 양성 대조군인 BHT와 유사하였다(Fig.
- 본 실험에서 HaCaT cell에 다양한 농도의 YM으로 1시간 동안 선처리 한 후 60 mJ/㎠의 강도로 UVB를 조사한 후 24시간 동안 배양한 후 배양액을 전기영동하여 관찰한 바 UVB는 MMP-9의 분비는 자극하였으나 MMP-2에는 영향을 미치지는 않았으며, 특히 YM은 500 ㎍/㎖의 농도에서 현저하게 MMP-9를 감소시킴을 확인하였다. HaCaT 세포를 이용하여 염증 및 주름과 연관된 유전자의 발현에서 UVB는 HaCaT 세포에서 MMP-9의 발현은 현저히 증가시켰으며 육미지황탕(YM)은 농도의존적으로 MMP-9의 발현을 감소시켰다. 그러나 MMP-3의 발현에는 별 영향을 미치지 않았다.
- SOD는 HaCaT cell lysate에서 육미지황탕 추출물 투여군이 대조군에 비해 농도의존적으로 유의성있게(p<0.05) 증가하였고, CAT는 HaCaT cell lysate에서 대조군에 비해 농도의존적으로 YM군에서 유의성있게(p<0.01 또는 p<0.05) 증가하였다.
- UVB를 어느 정도 자극했을 때 HaCaT 세포에서 MMP-9의 분비가 가장 많은지 관찰한 결과 60 mJ/㎠의 UVB에서 MMP-9의 분비가 가장 많았다(Fig. 7A). 육미지황탕(YM)의 HaCaT cell에서의 MMP-9의 분비에 대한 효능을 관찰하고자 gelatin zymographic assay를 시행하였다.
- UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물(YM)을 농도별로 첨가한 후 SOD의 효과를 관찰한 결과, 유해산소를 제거하는 효소인 SOD는 HaCaT cell lysate에서 대조군에서는 3.4±0.2 U/㎖이었으나 육미지황탕 추출물(YM) 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 5.2±0.3 U/㎖, 500 ㎍/㎖에서는 5.4±0.4 U/㎖, 1000 ㎍/㎖에서는 5.8±0.3 U/㎖로 농도의존적으로 YM군에서 유의적인 차이(P<0.05)를 보였다(Fig. 3).
- UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물(YM)을 농도별로 첨가한 후 XO의 생성량을 관찰한 결과, 유해산소를 생성하는 효소인 XO는 HaCaT cell lysate에서 대조군에서는 1.670±0.1 mU/㎖이었으나 육미지황탕(YM) 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 0.620±0.06 mU/㎖, 500 ㎍/㎖에서는 0.570±0.04 mU/㎖, 1000 ㎍/㎖에서는 0.530±0.05 mU/㎖로 모든 농도의 YM군에서 유의적인(p<0.01) 차이를 보였다(Fig. 2).
- UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물을 농도별로 첨가한 후 CAT의 효과를 관찰한 결과, CAT는 HaCaT cell lysate에서 대조군에서는 5.41±0.3 nmol/min/㎖이었으나 육미지황탕 추출물(YM) 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 8.89±0.4 nmol/min/㎖, 500 ㎍/㎖에서는 9.60±0.5 nmol/min/㎖, 1000 ㎍/㎖에서는 10.20±0.5 nmol/min/㎖로 농도의존적으로 YM군에서 유의적인 차이(p<0.01 또는 p<0.05)를 보였다(Fig. 4).
- UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕(YM)을 농도별로 첨가한 후 유해 활성산소 생성기인 XO의 생성은 육미지황탕 추출물 투여군이 대조군에 비해 농도의존적으로 유의성있게(p<0.01) 감소하였다.
- YM이 MMP-9의 활성을 직접적으로 억제하는지 관찰하고자 UVB를 조사한 HaCaT 세포의 배양액을 가지고 in vitro zymography를 시행하였다. 그 결과 MMP-9의 활성은 직접적으로 YM에 의하여 감소되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 7C).
- 또한 UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물을 농도별로 첨가하면 CAT는 HaCaT cell lysate에서 대조군에서는 5.41±0.3 nmol/min/㎖ 이었으나 YM 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 8.89±0.4 nmol/min/㎖, 500 ㎍/㎖에서는 9.60±0.5 nmol/min/㎖, 1000 ㎍/㎖에서는 10.20±0.5 nmol/min/㎖로 농도의존적으로 YM군에서 유의적인 차이(p<0.01 또는 p<0.05)를 보여 육미지황탕은 UVB 조사에 의하여 피부에 생성된 oxygen free radical을 소거하려는 생리적인 적응현상으로 SOD가 활성화 된 것으로 사료되었고, UVB 광노화에 의한 지방과 유기물의 자동산화에 의하여 발생한 H2O2 를 분해하기 위하여 육미지황탕 추출물에 의한 CAT의 활성이 증가한 것으로 사료되었다.
- DPPH 시약에 대해 YM을 10, 50, 100, 500, 1000 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 10-500㎍/㎖ 농도에서 진보라색을 탈색시켜 YM의 농도가 증가함에 따라 자유라디칼을 소거하는 활성도가 증가함을 관찰하였다. 또한 농도의존적으로 더욱 높은 활성을 보여 육미지황탕에는 항산화 활성을 갖는 유용한 성분들이 함유되어 있음을 확인할 수 있었고, 이러한 육미지황탕의 항산화 활성은 세포내에서 염증발현시 증가되는 산화적 스트레스에 대해 효과적으로 방어할 것으로 사료되었다.
- 본 실험에서 HaCaT cell에 다양한 농도의 YM으로 1시간 동안 선처리 한 후 60 mJ/㎠의 강도로 UVB를 조사한 후 24시간 동안 배양한 후 배양액을 전기영동하여 관찰한 바 UVB는 MMP-9의 분비는 자극하였으나 MMP-2에는 영향을 미치지는 않았으며, 특히 YM은 500 ㎍/㎖의 농도에서 현저하게 MMP-9를 감소시킴을 확인하였다. HaCaT 세포를 이용하여 염증 및 주름과 연관된 유전자의 발현에서 UVB는 HaCaT 세포에서 MMP-9의 발현은 현저히 증가시켰으며 육미지황탕(YM)은 농도의존적으로 MMP-9의 발현을 감소시켰다.
- 본 실험에서 UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물(YM)을 농도별로 첨가한 바 유해산소를 제거하는 효소인 SOD는 HaCaT cell lysate에서 대조군에서는 3.4±0.2 U/㎖ 이었으나 육미지황탕 추출물(YM) 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 5.2±0.3 U/㎖, 500 ㎍/㎖에서는 5.4±0.4 U/㎖, 1000 ㎍/㎖에서는 5.8±0.3 U/㎖로 농도의존적으로 육미지황탕 추출물 투여군에서 유의적인 차이(p<0.05)를 보였다.
- 본 실험에서는 UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물(YM)을 농도별로 첨가한 바대조군에서는 1.670±0.1 mU/㎖ 이었으나 육미지황탕 추출물(YM) 100 ㎍/㎖을 첨가한 군에서는 농도의존적으로 육미지황탕 추출물 투여군에서 유의적인(p<0.01) 차이를 보여 육미지황탕이 UVB에 의한 체내 유해 활성산소 생성기인 XO 저해작용을 야기시킨 것으로 사료되었다.
- 본 실험에서는 UVB를 조사한 HaCaT 세포에 육미지황탕 추출물(YM)을 농도별로 첨가한 후 유해산소를 생성하는 효소인 XO의 생성량을 관찰한 바 육미지황탕 추출물의 농도에 의존하여 유의성있게 감소하였고(p<0.01), 유해산소를 제거하는 효소인 SOD는 YM군이 대조군에 비해 농도 의존적으로 유의성있게(p<0.05) 증가하였다 또한 CAT도 대조군에 비해 농도 의존적으로 YM군에서 유의성있게(p<0.01 또는 p<0.05) 증가하여 유해 활성산소 생성계 효소(XO)의 활성도를 억제하였고, 또한 유해 활성산소 제거계 효소(SOD와 CAT)의 활성도를 증가시킴을 알 수 있었다.
- 001). 육미지황탕(YM)의 HaCaT 세포에서의 MMP-9의 분비에 대한 효능은 500 ㎍/㎖의 농도에서 현저하게 감소함을 확인하였고, MMP-9의 활성은 직접적으로 육미지황탕에 의하여 감소하지 않음을 확인할 수 있었다.
- 육미지황탕(YM)의 자유라디칼 소거능력은 10-500 ㎍/㎖의 농도에서 활성도가 증가하였으며, 활성산소종(ROS)의 생성도 육미지황탕의 농도에 비례하여 농도 의존적으로 유의성 있게 억제되었다(p<0.05, p<0.01, p<0.001).
- 육미지황탕의 염증 및 주름과 연관된 유전자의 발현은 육미지황탕의 농도에 비례하여 MMP-9의 발현을 감소시켰고, 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-1β의 발현은 감소시켰으나 현저하지는 않았다.
- 6). 이러한 결과 YM은 세포 내 ROS의 생성을 억제하는 효능을 수행하는 기능이 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 육미지황탕은 기와 혈을 보하고 인체의 음양과 장부의 기능실조를 조정하여 질병에 대한 저항력을 증강시켜 질병의 발생을 억제하고 치료하는데 중요하다. 신장과 간을 보하는 육미지황탕을 이용하여 광노화피부와 관련된 연구는 진행된 바 없고, 보음제의 대표적인 처방인 육미지황탕이 항산화, 아토피피부염 관련 제반 증상 완화 및 면역조절을 통한 항염증 등의 효과가 있다고 보고되고 있으나 광노화피부와 관련된 연구는 진행된 바 없으므로 본 연구에서 육미지황탕을 이용하여 생화학적 및 분자생물학적으로 체계적인 광노화 피부의 억제에 관한 연구가 필요하였다.
- 이상의 실험 결과로 육미지황탕은 UVB에 의한 피부 광노화를 억제시킬 것으로 사료되었으며, 자외선 손상에 의한 광노화 피부에서 육미지황탕의 개별 약재에 대한 심도있는 연구가 추후에 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 실험 결과로 육미지황탕은 자외선에 의한 광노화피부를 야기하는 여러 가지 인자들의 활성을 억제 할 것으로 사료되어 광노화에 의한 피부손상을 예방할 수 있는 생리활성이 있는 기능성 화장품소재로서 활용이 가능할 것으로 판단된다.
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