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문제 정의
- 이들 전하를 띠는 아미노산 중에서 Figure 1에서 보듯이 29번째 위치에 있는 라이신(K29)은 16번째 위치에 있는 글루탐산(E16)과 21번째 위치에 있는 아스파르트산(D21)과 삼차원 입체구조에서 서로 가까이 위치하여서 정전기적 상호작용을 할 것으로 여겨졌다. 따라서 본 연구에서는 K29를 전하를 띠지 않는 곁사슬을 가진 아미노산인 알라닌으로 치환하여 정전기적 상호작용이 단백질 폴딩 과정에 미치는 영향을 탐색하였다. 더욱이 K29의 곁사슬은 상당부분이 용액에 노출되어 있어서 정전기적 상호작용 외에 다른 비공유결합은 그리 많이 하지 않을 것으로 생각되며 알라닌으로 치환할 시 정전기적 상호작용을 잃는 것 외에 다른 비공유결합은 크게 영향을 받지 않을 것으로 여겨졌다.
- 본 연구에서는 단백질 폴딩 반응을 연구하기에 적절한 모델이 되며 또한 폴딩 반응 메커니즘이 비교적 잘 알려진 WT* 유비퀴틴을 기반으로 하여 전하를 띠는 아미노산을 전하를 띠지 않는 아미노산으로 치환한 변이 유비 퀴틴 단백질을 제조하여 정전기적 상호작용이 단백질 삼차원 구조의 안정성 및 형성 과정에 미치는 영향을 탐색하고자 한다. 이러한 연구는 단백질 삼차구조를 안정화시키는 비공유결합의 일종인 정전기적 상호작용이 폴딩 반응 과정에서의 역할은 어떠한지 탐색하는데 유용한 정보를줄 것으로 기대된다.
- 따라서 정전기적 상호작용은 단백질의 삼차원구조가 형성되는 과정인 폴딩 반응의 초기에 형성되어 폴딩 반응을 이끌어가는 역할을 할 수 있거나 또는 삼차원 입체구조의 골격이 다른 비공유결합에 의하여 거의 이루어진 다음에 형성되어 단백질 폴딩 반응을 이끌어가지는 않고 단지 삼차원 구조를 안정화시키는 역할만 할 수도 있다. 본 연구에서는 정전기적 상호작용이 유비퀴틴 단백질의 폴딩 반응에 어떻게 작용하는지 탐구하여 보았다.
- 정전기적 상호작용의 단백질 폴딩 과정에서의 역할을 알아보기 위하여 단백질 폴딩 반응을 연구하는데 모델 단백질로 자주 사용되었던 유비퀴틴 단백질의 삼차원 입체구조16를 관찰하였다. 유비퀴틴 단백질은 76 개의 아미노산으로 이루어진 매우 작은 단백질로서 양전하를 띠는 아미노산인 라이신과 아르기닌 잔기가 각각 7 개와 4 개, 음전하를 띠는 아스파르트산과 글루탐산 잔기가 각각 5개와 6 개가 있어서 이들 전하를 띠는 아미노산들이 유비 퀴틴의 표면에서 서로 정전기적 상호작용을 하고 있을 것으로 기대되었다.
가설 설정
- WT* 유비퀴틴의 guanidinium chloride에 의한 폴딩 실험에서 Khorasanizadeh et al.도 중간 단계를 발견하였고 중간 단계가 unfolded state에서 native state로 진행하는 경로 상에 존재한다는 가정을 바탕으로 결과를 분석하여 three-state on-pathway 폴딩 메커니즘(Scheme 1) 이 three-state off-pathway 메커니즘이나 three-state triangular 메커니즘보다 더 적합하다고 해석하였다.5 이들은 three-state on-pathway 메커니즘(Scheme 1)에 입각하여 계산한각 elementary 반응의 상수들은 guanidinium chloride를 변성 제로 사용한 WT* 유비퀴틴의 폴딩 반응을 stopped-flow 장치로 관찰하여 얻은 속도 상수와 진폭을 잘 묘사하는 반면 off-pathway 메커니즘은 그리 잘 묘사하지 않으며, 또한 triangular 메커니즘은 on-pathway 메커니즘이나 off-pathway 메커니즘으로 환원될 수 있기 때문에 고려하지 않아도 되는 것으로 해석하였다.
- 이 가정했던 것과 마찬가지로 kUIo와 mUI‡를 각각 1.0 ×104 sec−1와 0으로 가정하였고, mIN‡도 거의 0에 가깝다는 이들의 경험적 발견을 차용하였다.
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