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문제 정의
- 본 연구에서는 불량식품 사례가 있는 토끼와 고양이의 동시분석법을 개발하여 차후 발생할 수 있는 불량식품을 사전에 관리하는데 활용되도록 하였다. 이를 위해 미토콘드리아의 cytochrome b (cyt b) gene을 대상 유전자로하여 PCR에 필요한 프라이머를 개발하고 PCR 분석법의 효율을 검토하였다.
제안 방법
- RNase A (100 mg/mL)를 4 µL 가하고 실온에서 2분간 반응시킨 후 Kit에 포함된 AL 완충액 400 µL와 100% 에탄올 400 µL을 가하였다.
- 본 연구에서는 불량식품 사례가 있는 토끼와 고양이의 동시분석법을 개발하여 차후 발생할 수 있는 불량식품을 사전에 관리하는데 활용되도록 하였다. 이를 위해 미토콘드리아의 cytochrome b (cyt b) gene을 대상 유전자로하여 PCR에 필요한 프라이머를 개발하고 PCR 분석법의 효율을 검토하였다.
- 토끼(Oryctolagus cuniculus)와 고양이(Felis catus)는 경기도 성남시 소재 재래시장에서 육안으로 확인 후 도축한 것을 구입하였고 실험실로 운반 즉시 근육부분을 취하여 흐르는 물에 충분히 씻은 후 물기를 제거하고 50 mL 튜브에 넣어 −20oC에 보관 하였다. 시료를 사용할 때는 액체질소를 이용하여 막자사발로 마쇄한 시료를 취하여 DNA를 추출하였다. 21종의 동물 근육 중 토끼와 고양이를 포함한 칠면조, 타조, 닭, 꿩, 오리, 거위, 소, 양, 돼지, 말, 염소, 개, 사슴, 당나귀 등 16종은 시중에서 구입하였고, 비둘기, 쥐, 다람쥐, 청설모, 고라니 등 5종은 서울대학교 수의과대학 야생동물유전자원은행 (www.
- 프라이머 개발. 토끼와 고양이 미토콘드리아의 cyt b gene을 target으로 해서 GenBank 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)와 Clustal Omega alignment분석(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)을 활용하여 토끼, 고양이의 cyt b gene 염기서열을 20종의 동물 염기서열과 비교하였다. Primer Designer 프로그램 버전 3.
- uk/Tools/msa/clustalo)을 활용하여 토끼, 고양이의 cyt b gene 염기서열을 20종의 동물 염기서열과 비교하였다. Primer Designer 프로그램 버전 3.0 (Scientific and Educational Software, USA)을 사용하여 종 특이 프라이머를 디자인 하였고 프라이머 합성은 Bionics (Korea)에 의뢰하였다. PCR 산물의 크기는 가공처리를 거칠 경우에 대비하여 200 bp 이하가 되도록 하였고 (Arslan 등, 2006; Haunshi 등, 2009) 동시검출을 위하여 PCR annealing 온도차이는 최소가 되도록 설계하였다.
- 0 (Scientific and Educational Software, USA)을 사용하여 종 특이 프라이머를 디자인 하였고 프라이머 합성은 Bionics (Korea)에 의뢰하였다. PCR 산물의 크기는 가공처리를 거칠 경우에 대비하여 200 bp 이하가 되도록 하였고 (Arslan 등, 2006; Haunshi 등, 2009) 동시검출을 위하여 PCR annealing 온도차이는 최소가 되도록 설계하였다. 프라이머의 염기서열은 Table 1에 정리하였고 target gene의 염기서열 alignment와 디자인한 프라이머의 위치는 Fig.
- 2 U, 각 프라이머는 토끼의 경우는 400 nM, 고양이의 경우는 320 nM씩의 최종 농도가 되도록 하였다. PCR 반응 조건은 94oC에서 5분 예비가열 후 94oC에서 30초간 변성, 60oC에서 30초간 결합, 72oC에서 30초간 신장의 과정을 30회 반복하였고 마지막에 72oC에서 7분간 처리하였다. 증폭된 PCR 산물은 3% agarose gel에서 전기영동으로 확인하였고, Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 이용해 재확인하였다.
- PCR 반응 조건은 94oC에서 5분 예비가열 후 94oC에서 30초간 변성, 60oC에서 30초간 결합, 72oC에서 30초간 신장의 과정을 30회 반복하였고 마지막에 72oC에서 7분간 처리하였다. 증폭된 PCR 산물은 3% agarose gel에서 전기영동으로 확인하였고, Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, USA)를 이용해 재확인하였다.
- 프라이머의 특이성과 분석법의 검출한계. 개발된 프라이머의 특이성 확인을 위해 토끼 또는 고양이 이외에 19종의 동물을 시료로 하여 PCR 반응을 통해 프라이머의 특이성을 검토하였다. 개발된 duplex PCR 분석법의 검출한계 측정을 위해 고양이와 토끼의 DNA 각 50 ng을 10배씩 단계별로 0.
- 개발된 프라이머의 특이성 확인을 위해 토끼 또는 고양이 이외에 19종의 동물을 시료로 하여 PCR 반응을 통해 프라이머의 특이성을 검토하였다. 개발된 duplex PCR 분석법의 검출한계 측정을 위해 고양이와 토끼의 DNA 각 50 ng을 10배씩 단계별로 0.00005 ng까지 희석하여 사용하였다.
- 프라이머의 특이성. 토끼와 고양이의 종 특이 프라이머의 특이성을 확인하기 위하여 21종의 동물시료로부터 DNA를 추출하여 single PCR을 수행하였고 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 고양이와 토끼의 PCR product size는 각각 191, 101 bp이었고 두 프라이머 모두 다른 동물의 DNA는 증폭시키지 않고 고양이와 토끼 DNA와만 특이적으로 반응하였다(Fig.
- 2에 나타내었다. 고양이와 토끼의 PCR product size는 각각 191, 101 bp이었고 두 프라이머 모두 다른 동물의 DNA는 증폭시키지 않고 고양이와 토끼 DNA와만 특이적으로 반응하였다(Fig. 2). Ali 등(2015)의 연구에서 고양이 검출을 위해 미토콘드리아 cyt bgene을 대상으로 개발한 프라이머를 이용했을 경우 PCR 산물의 크기는 172 bp로 본 연구의 191 bp보다 좀 더 작은 크기였다.
- PCR 반응액 25 µL 중 10X 완충액(Applied Biosystems Inc., USA)은 2.5 µL, 시료 DNA (50ng/µL) 1 µL, 200 µM dNTPs, MgCl2는 1.5 mM, Ampli Gold Taq polymerase (Applied Biosystems Inc.)는 0.2 U, 각 프라이머는 토끼의 경우는 400 nM, 고양이의 경우는 320 nM씩의 최종 농도가 되도록 하였다.
대상 데이터
- 토끼(Oryctolagus cuniculus)와 고양이(Felis catus)는 경기도 성남시 소재 재래시장에서 육안으로 확인 후 도축한 것을 구입하였고 실험실로 운반 즉시 근육부분을 취하여 흐르는 물에 충분히 씻은 후 물기를 제거하고 50 mL 튜브에 넣어 −20oC에 보관 하였다.
- 시료를 사용할 때는 액체질소를 이용하여 막자사발로 마쇄한 시료를 취하여 DNA를 추출하였다. 21종의 동물 근육 중 토끼와 고양이를 포함한 칠면조, 타조, 닭, 꿩, 오리, 거위, 소, 양, 돼지, 말, 염소, 개, 사슴, 당나귀 등 16종은 시중에서 구입하였고, 비둘기, 쥐, 다람쥐, 청설모, 고라니 등 5종은 서울대학교 수의과대학 야생동물유전자원은행 (www.cgrb.org)에서 분양 받아 사용하였다.
이론/모형
- DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Germany)를 사용하였고 추출법은 키트의 매뉴얼에 따랐다.
성능/효과
- 흡착된 DNA를 50 µL의 3차증류수로 용출하여 UV spectrophotometer (UV-1700, Shimadzu, Japan)를 사용해서 추출한 DNA의 농도를 측정하였고 순도는 260/280 nm에서의 흡광도를 비교하여 1.8–2.0 사이임을 확인하였다.
- Yang 등(2014)은 고릴라, 원숭이 등 유사종과 유사도가 적은 소, 생쥐, 개구리, 은어의 미토콘드리아 DNA의 종간 및 종내의 차이를 검토하여 특정 종의 미토콘드리아 DNA가 다른 종들의 미토콘드리아 DNA와 얼마나 상동성을 보이는지를 검토하였고 종 특이 판별법에서 가장 중요한 것은 프라이머의 특이성이라고 보고하였다. 본 연구의 특이성 검증 대상 21종에는 식품 원료로 흔히 사용되는 가축류와 가금류가 포함되어 있었고 국내외에서 불량식품 사례가 보고된 동물 종들도 포함되었기 때문에 개발된 duplex PCR 법을 사용하면 이들을 원료로 한 식품 중에 토끼나 고양이의 혼입 여부 또는 고양이를 토끼로 속여 파는지의 여부를 알아낼 수 있다고 판단된다.
- 1 ng이었다. 본 연구에서 개발된 duplex PCR의 정성적 검출한계는 토끼는 0.005 ng (5 pg), 고양이는 0.0005 ng (0.5 pg)이었다. Fig.
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