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문제 정의
- 본 연구에서는 목향 추출물이 세포전달체계에 있어서 NO (nitric oxide) 항상성에 연관하여 항산화효과(antioxidant)와 그 효능 및 작용기전을 밝히고, 약리학적 연구하고자 한다. 구강질환 뿐만 아니라 다양한 염증성 궤양과 같은 산화적 스트레스로 인한 질병연구에 있어서 항상성에 대한 연구와 질병의 예방 및 치료를 위한 융복합 연구의 기초 자료를 제공하고자 한다.
- 본 연구에서는 목향 추출물이 세포전달체계에 있어서 NO (nitric oxide) 항상성에 연관하여 항산화효과(antioxidant)와 그 효능 및 작용기전을 밝히고, 약리학적 연구하고자 한다. 구강질환 뿐만 아니라 다양한 염증성 궤양과 같은 산화적 스트레스로 인한 질병연구에 있어서 항상성에 대한 연구와 질병의 예방 및 치료를 위한 융복합 연구의 기초 자료를 제공하고자 한다.
제안 방법
- 1.0 μg denatured RNA를 Maxime RT PreMix Kit(iNtRON Biotech, Korea)를 이용하여 45℃에서 60분, 95℃에서 5분 동안 반응시켜 cDNA로 합성하였다.
- 5×105 cells/well에 24시간 배양하고, 배양, 목향의 에탄올 추출물(SL)을 농도별(2.5, 5, 7.5ug/ml)로 처리하고, 100 ng/ml의 LPS를 첨가하여 샘플링하였다.
- 96well plate의 각 well에 세포부유액 0.1 mL(1×105 cells/ml)을 접종하여 37℃의 CO2배양기에서 24시간 배양한 후 목향의 에탄올 추출물(SL)을 농도별(1, 2.5, 5, 7.5 그리고 10 μg/ml) 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
- LPS(lipolysaccharide)로 활성화를 유도한 Raw 264.7 세포를 대상으로 안정한 산화 생성물인 질산이온(NO3-) 의 생성에 미치는 각각의 추출물의 영향을 측정하였다. Raw 264.
- Macrophage cell인 Raw 264.7 세포는 LPS로 세포를 활성화 시킨 후 유도되는 iNOS에 대한 목향 에탄올 추출물의 억제효과를 RT-PCR로 확인하였다. 특히 농도 의존적으로 억제되는 것을 보였다[Fig.
- PCR(polymerase chain reaction) 은 합성된 cDNA로부터 TNF-α, IL-1β, COX-2, iNOS 그리고 β-actin를 증폭시키기 위해서 1 μl(equivalent to 0.3 μg RNA)의 cDNA를 GoTaq® Green Master Mix (promega, USA) 와 10 pM의 specific primer 를 첨가하여 PCR을 시행하였으며, PCR은 Mastercycler (eppendorf, USA)에서 수행하였다.
- PCR에 의하여 생성된 산물은 1.2% agarose gel에서 전기영동(Gel electrophoresis) 으로 확인하였다.
- Raw 264.7세포에 목향의 에탄올 추출물(SL)을 0, 2.5, 5, 그리고 7.5 μg/ml의 농도로 전처리한 후, LPS 100 ng/ml을 20시간 배양하여 RT-PCR을 수행하였다.
- 각 well에 10 ul의 Ez-Cytox 시약을 첨가하여 37℃에서 3시간 배양한 후 흡광도를 ELISA reader(Emax, Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서 측정하여 대조군과 비교하여 cell viability를 측정하였다.
- 대조군의 중앙값을 기준으로 실험군의 O.D 측정값을 퍼센트로 환산한 결과, 농도별 목향 에탄올 추출물(SL)을 1, 2.5, 5, 7.5 그리고 10 μg/ml 씩 농도별로 투여하고, 24시간 후에 세포 생존률(Cell viability)을 확인하였다.
- 5]. 목향의 에탄올 추출물(SL)을 이용하여 NO(nitric oxide) 항상성에 영향을 미치는 요인들에 대한 효과를 분석하였다. 목향의 에탄올 추출물은 Raw 264.
- 목향의 에탄올 추출물의 염증 억제 효과를 분석하기 위해서 질산이온(NO3-)의 생성 억제 여부를 확인하였다. [Fig.
- 반응이 끝난 후 반응액과 동일한 양의 Griess 시약 [2.5% (v/v) phosphoric acid에 1% (w/v) sulfanilamide와 0.1% (w/v) naphyethylenediamine]을 첨가하였다.
- 세포의 상층액을 이용하여 NO양을 nitrate와 nitrite로 측정하였다. 10 mM SNP용액 100 μl에 시료를 농도별로 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 실온에서 10분 동안 차폐상태에서 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 잔존하는 아질산염(nitrate)의 양으로 nitric oxide(NO) 소거 활성을 %로 산출하였다.
- 건조된 시료 300g을 분쇄하여 에탄올 1L 을 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출을 실시하였다. 충분하게 추출단계를 거친 후에 여과지 (ADVANTEC, NO. 2)로 감압여과를 실시하였다. 시료 추출과정은 Park 등[13]이 기술한 방법을 인용을 하였다.
대상 데이터
- 시료로 사용된 목향(木香, Radix Sausurea Seu Inulea)은 국내산 제품으로 인터넷에서 구입한 후 정량하여 실험에 사용하였다. 건조된 시료 300g을 분쇄하여 에탄올 1L 을 가하여 상온에서 3일 동안 정치시켜 추출을 실시하였다.
- 5 그리고 10 μg/ml 씩 농도별로 투여하고, 24시간 후에 세포 생존률(Cell viability)을 확인하였다. 정상군(NC)와 유사한 비율로 생존한 농도를 실험에 사용하였다. 정상군(NC)과 비교하여 목향에탄올 추출물(SL)의 1, 2.
데이터처리
- 실험결과의 통계처리는 Window용 SPSS 21.0 version (SPSS Inc)을 사용하였으며, 모든 측정값은 평균±표준 오차(Mean±SEM)로 표시하였고, 분석에 대한 유의성은 Student's t-test로 검증 하였으며, p<0.05 에서 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
- 측정된 흡광도 값은 시료를 처리하지 않는 군을 100으로 했을 때 산출한 %값으로 세포독성 평가를 실시하였다.
이론/모형
- 세포 독성평가는 EZ-CyTox Enhanced cell viability assay kit (Daeil Lab)을 사용하여 측정하였다. 96well plate의 각 well에 세포부유액 0.
- 2)로 감압여과를 실시하였다. 시료 추출과정은 Park 등[13]이 기술한 방법을 인용을 하였다.
성능/효과
- LPS단독 처리군에서 NO 생성량이 100%로 정했을 때, 목향의 에탄올 추출물(SL)에서는 1 μg/ml 48%, 5와 10 μg/ml에서는 30%이하로 현저하게 감소하였으며, 정상군(NC)와 거의 유사한 양만큼 감소하는 것을 확인할 수 있었다[Fig. 2].
- 목향의 에탄올 추출물의 항산화작용의 약리학적 메카니즘을 규명하기 위하여 NO생성에 중요한 효소인 iNOS 발현에 대한 실험을 실시한 결과, LPS만 처리한 실험 결과와 비교하여 볼 때 목향의 에탄올 추출물(SL)를 농도 별로 감소하는 패턴을 보였다[Fig. 4].
- 염증반응의 매개물질인 prostaglandin의 합성에 중요한 역할을 하는 COX-2(cyclooxygenase-2)는 목향의 에탄올 추출물에 의하여 억제되는지를 실시한 결과, LPS만 처리한 실험 결과와 비교하여 볼 때 목향의 에탄올 추출물(SL)을 처리한 그룹에서 농도별로 감소하는 패턴을 보였다. 다시 말하면 목향의 에탄올 추출물에 의해 COX-2 의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 감소하는 경향을 보여주고 있다[Fig.
- 정상군(NC)과 비교하여 목향에탄올 추출물(SL)의 1, 2.5, 5, 그리고 7.5 μg/ml 농도에서는 거의 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었으며, 10 μg/ml에서 정상군(NC)에 비해 다소 세포수가 다소함을 알 수 있었다[Fig. 1].
- 특히 혈관계 및 면역계에서 세포 간의 작용을 매개한다고 알려져 있다[20]. 조직에 염증이 발생하면 프리라디칼이 증가하여 nitric oxide생성이 증가하는데 목향의 에탄올 추출물들이 이러한 염증 nitric oxide 양을 억제함을 확인할 수 있었고[Fig. 2], 이는 염증반응의 항상성에 영향을 미치는 것으로 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 결과는 목향의 에탄올 추출물이 생체 내 전반적인 염증반응에 작용할 수 있음을 제시함으로써 염증억제제로서의 사용 가능성을 나타내고 있다. 앞으로 목향이 각 세포에 미치는 분자융복합 수준의 작용기전에 대해서 좀 더 연구할 필요성이 있다.
- 이러한 결과는 목향의 에탄올 추출물이 생체 내 전반적인 염증반응에 작용할 수 있음을 제시함으로써 염증억제제로서의 사용 가능성을 나타내고 있다. 앞으로 목향이 각 세포에 미치는 분자융복합 수준의 작용기전에 대해서 좀 더 연구할 필요성이 있다.
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