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문제 정의
- ) Kummer]만이 보고되어 있다[5]. 빨판애주름버섯으로 기록되어 HCCN에 보존되어 있는 표본을 재조사 관찰하여 세밀한 종 특징기술을 하고internal transcribed spacer (ITS) 염기서열 정보 분석하여 새로운 신종으로 동정하고 학명과 한국명을 신칭하고, 그 결과를 보고하고자 한다. 또한 발광을 하는 버섯류가 포함된 section Exornatae의 받침대애주름버섯(M.
제안 방법
- 분자생물학적인 동정을 위해 자실체로부터 포자 분리한 빨판애주름버섯의 4균주(Table 1)를 25℃, potato dextrose agar (PDA)에 배양하고, DNA는 배양된 균사를 일정량 긁어내어 cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 추출법으로 추출하였다[8]. ITS 염기서열을 증폭하기 위해 ITS1(5-TCCGTAGGTGA ACCTGCG-3)과 ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) primer를 사용하였다[9]. Polymerase chain reaction (PCR) 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 5분, denaturation 94℃ 1분, annealing 56℃ 1분, extension 72℃ 1분 순으로 총 35 cycles, final extension 72℃ 10분으로 진행하였다.
- PCR산물은 purification kit (AccuPrep PCR & Gel Extraction Kit; Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 정제한 후 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하고 분석된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information의 BLAST program을 사용하여 GenBank에 등록되어 있는 sequence data와 비교하였다.
- ITS 염기서열을 증폭하기 위해 ITS1(5-TCCGTAGGTGA ACCTGCG-3)과 ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) primer를 사용하였다[9]. Polymerase chain reaction (PCR) 반응조건은 pre-denaturation 94℃ 5분, denaturation 94℃ 1분, annealing 56℃ 1분, extension 72℃ 1분 순으로 총 35 cycles, final extension 72℃ 10분으로 진행하였다. PCR산물은 purification kit (AccuPrep PCR & Gel Extraction Kit; Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 정제한 후 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하고 분석된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information의 BLAST program을 사용하여 GenBank에 등록되어 있는 sequence data와 비교하였다.
- 빨판애주름버섯으로 기록되어 HCCN에 보존되어 있는 표본을 재조사 관찰하여 세밀한 종 특징기술을 하고internal transcribed spacer (ITS) 염기서열 정보 분석하여 새로운 신종으로 동정하고 학명과 한국명을 신칭하고, 그 결과를 보고하고자 한다. 또한 발광을 하는 버섯류가 포함된 section Exornatae의 받침대애주름버섯(M. chlorophos)과는 ITS 염기서열로 비교검토 하였다.
- 현미경적 미세구조의 특징 관찰을 위하여 건조표본은 주름살이 부착되어 있는 갓 일부 절편을 물에 3분정도 침적 후 70% 알코올에 옮겨 3분간 침적하였으며, 이를 6회 실시하여 시료를 원상태로 재생하였다. 재생된 절편을 수수깡 속에 끼우고 면도날로 얇게 절단한 후, 세절편을 슬라이드글라스 위에 놓고 1% Congo red 용액이나 1% phloxine 용액으로 염색한 후 cover glass를 덮고 즉시 3%KOH 용액으로 세척한 후 관찰하였다. 현미경적인 구조의 스케치는 드로잉튜브가 부착된 현미경(Leitz Diaplan; Leica, Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 포자, 담자기, 시스티디아 등의 크기 모양, 표면의 구조 등을 조사하였고, 기부의 협구 유무, 자실층 조직, 표피상층(pileipellis) 등 미세구조의 특징을 세밀하게 조사하였다.
- 자실체의 동정을 위한 형태적인 특성조사중 육안적인 특성은 갓의 크기, 모양, 갓 표면의 구조와 색, 갓 끝의 특징 등을 기술하였고, 주름살은 크기, 색, 주름살날 특징 등을, 대는 크기, 모양, 대표면의 상태, 색, 대기부의 특징, 포자문 등을 기술하였다[6]. 현미경적 미세구조의 특징 관찰을 위하여 건조표본은 주름살이 부착되어 있는 갓 일부 절편을 물에 3분정도 침적 후 70% 알코올에 옮겨 3분간 침적하였으며, 이를 6회 실시하여 시료를 원상태로 재생하였다. 재생된 절편을 수수깡 속에 끼우고 면도날로 얇게 절단한 후, 세절편을 슬라이드글라스 위에 놓고 1% Congo red 용액이나 1% phloxine 용액으로 염색한 후 cover glass를 덮고 즉시 3%KOH 용액으로 세척한 후 관찰하였다.
- 재생된 절편을 수수깡 속에 끼우고 면도날로 얇게 절단한 후, 세절편을 슬라이드글라스 위에 놓고 1% Congo red 용액이나 1% phloxine 용액으로 염색한 후 cover glass를 덮고 즉시 3%KOH 용액으로 세척한 후 관찰하였다. 현미경적인 구조의 스케치는 드로잉튜브가 부착된 현미경(Leitz Diaplan; Leica, Microsystems, Wetzlar, Germany)으로 포자, 담자기, 시스티디아 등의 크기 모양, 표면의 구조 등을 조사하였고, 기부의 협구 유무, 자실층 조직, 표피상층(pileipellis) 등 미세구조의 특징을 세밀하게 조사하였다. 모든 표본은 학술적 자료로 영구 보존하기 위하여 약 40℃로 6~12시간 열풍 건조하여 상대습도 40 ± 2%, 18~20℃, 암실에 보존하고 있다.
대상 데이터
- 2015년에 새롭게 채집한 표본은 성장시기별로 여러 개체의 자실체를 채집하였고, 사진은 Power shot 650 (Cannon, Melville, NY, USA)으로 생육지에서 촬영하였다. 자실체의 동정을 위한 형태적인 특성조사중 육안적인 특성은 갓의 크기, 모양, 갓 표면의 구조와 색, 갓 끝의 특징 등을 기술하였고, 주름살은 크기, 색, 주름살날 특징 등을, 대는 크기, 모양, 대표면의 상태, 색, 대기부의 특징, 포자문 등을 기술하였다[6].
- 국내에 자생하는 빨판애주름버섯의 재동정을 위하여1988년부터 2015년까지 강원도 치악산 등 23개 지역에서수집하고 M. stylobates으로 기록되어 국립농업과학원식물균류표본보존센터(HCCN)에 보관된 39개 표본의 형태관찰에 의한 재동정을 실시하였다[5].
- 분자유전학적 계통분석을 위해 GenBank에 등록된 애주름버섯속(genus Mycena) 35종의 염기서열 그리고 외군으로 Hemimycena ochrogaleata의 염기서열을 본 연구에 사용하였다. 염기서열의 다중염기서열정렬(alignment)은 ClustalX 1.
데이터처리
- 4)과 같이 계통수로 나타내었다. ML tree를 기반으로 하여 Bayesian inference를 통한 posterior probability (PP)로 계통수의 branch 값의 신뢰도를 높였다.
- 5 program [11]을 사용하여 수정하였다. 분자유전학적 계통분석을 위해 MEGA 6.0 program [12]을 사용한 maximum likelihood (ML) analysis와 MrBayes v3.1.2 program [13]을 사용한 Bayesian inference (BI)를 각각 수행하였다. ML tree는 1,000번의 bootstrap 분석을 수행하였고, bootstrap 값 60% 이상만 계통수에 사용하였다.
이론/모형
- ML tree는 1,000번의 bootstrap 분석을 수행하였고, bootstrap 값 60% 이상만 계통수에 사용하였다. BI는 metropolis-coupled Markov-chain Monte Carlo (MCMC) 방법을 사용하여 하나의 cold chain, 세 개의 heated chain이 26 generation 진행하는 동안 split frequency의 표준편차가 0.01 미만이 되었을 때 얻어진 계통수를 사용하였다. BI 값은 0.
- 분자생물학적인 동정을 위해 자실체로부터 포자 분리한 빨판애주름버섯의 4균주(Table 1)를 25℃, potato dextrose agar (PDA)에 배양하고, DNA는 배양된 균사를 일정량 긁어내어 cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 추출법으로 추출하였다[8]. ITS 염기서열을 증폭하기 위해 ITS1(5-TCCGTAGGTGA ACCTGCG-3)과 ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) primer를 사용하였다[9].
- 모든 표본은 학술적 자료로 영구 보존하기 위하여 약 40℃로 6~12시간 열풍 건조하여 상대습도 40 ± 2%, 18~20℃, 암실에 보존하고 있다. 색상은 Methuen Hand book of Color을 참조하여 기술하였다[7].
성능/효과
- 0, LB = 99)으로 독립된 하나의 분류군을 형성하였다. 근연종인 M. chlorophos와는 527/563 (94%)의 상동성을 보였으며, M. deeptha와는 552/636 (87%)로 계통학적으로 차이를 보였다.
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