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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 tryptophan 생합성상에서 feedback inhibition에 민감하게 반응하는 AS alpha-subunit 관련 OASA2 유전자 영역에 F124V 및 S126F/L530D으로 변형된 유전자를 이용하여 형질전환체를 육성하고, 형질전환 후대에서 tryptophan 함량이 높은 계통을 이벤트화하여 GM벼를 개발을 하고자 수행하였다.
제안 방법
- 형질전환 벼 육성을 위하여 동진 벼 종자를 2 mg/L 2,4-D가 포함된 N6 액체배지에 침종하여 30°C 암상태에서 24 시간 동안 발아시켜, 배 부분이 부풀어 오르기 시작한 종자를 15 mL의 Agrobacterium 현탁액이 담겨있는 튜브에 담가 약 20 분간 접종한 다음 멸균한 필터페이퍼 위에 종자를 올려놓아 여분의 Agrobacterium을 제거하였다.
- Agrobacterium을 접종한 종자를 1 mM dithiothreitol (DTT), 3 mg/L silver nitrate (AgNO3), 0.5% gelrite가 포함된 2N6-AS 배지 위에 필터페이퍼를 놓고 치상하여 25°C 암조건에서 3 일간 공동 배양하였고, 그 후 배지 성분의 영향력을 높이기 위해 필터페이퍼를 제거한 배지에 치상하여 25°C 암조건에서 4 일간 공동 배양하였다(Lee et al. 2011; Jung et al. 2014).
- 선발된 개체로부터 유전자를 분리하고 염기서열 분석을 수행한 결과 OsASA2 (anthranilate synthase) 유전자의 124번째 아미노산인 TTC (phenylalanine)가 GTC (Valine)으로 변이된 개체(F124V)와 126번째 아미노산인 TCC (Serine)가 TTC (phenylalanine)로 변이되고, 530번째 아미노산인 CTT (Leucine)가 GAC (aspartic acid)로 변이된 개체(S126F/L530D)를 확인할 수 있었다(data not shown). 두 가지 유형의 점돌연변이가 발생한 OsASA2 유전자를 각각 single mutation (F124V)과 double mutation (S126F/L530D)이라고 명명하고 분리한 후 식물발현벡터에 도입하였다.
- 식물 형질전환용 운반체는 pPGD1 벡터를 모벡터로 사용하여 OsASA2 (anthranilate synthase) 유전자를 CaMV 35S 및 PDG1 프로모터에 연결하여 제작하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 Bar 유전자를 이용하였다.
- 식물 형질전환용 운반체는 pPGD1 벡터를 모벡터로 사용하여 OsASA2 (anthranilate synthase) 유전자를 CaMV 35S 및 PDG1 프로모터에 연결하여 제작하였다. 형질전환된 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서는 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 Bar 유전자를 이용하였다. 식물 발현용 vector의 구축이 확인된 plasmid를 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환 시켰다.
- 2014). 형질전환실험에서 얻어진 재분화 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에서 OsASA2 유전자의 도입을 확인하기 위해 재분화된 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 이때 사용한 Bar 유전자 프라이머는 forward 5'-CGTCAACCACTACATCGAGA-3', reverse 5'-AAGTCCAGCTCGCAGAAA-3'로 제작하였고, PGD1 promoter forward 프라이머는 5'-TAGCTCTTAAC TTGCATGTC-3', OsASA2 유전자 프라이머는 forward: 5'- ATGGAGTCCATCGCCGCCGCCA-3', reverse: 5'-AGAGGTTTGAGAGGCGAAC-3'로 제작하여 95°C에서 6분간 pre- denaturation 시킨 후, 94°C에서 30 초간 denaturation, 58°C에서 30 초간 annealing, 72°C에서 1 분간 extension 과정을 30 cycles하였으며, 마지막으로 72°C에서 5 분간 extension을 실시하여 분석하였다.
- TaqMan probe real-time PCR을 위하여 2 × Brilliant ∥ QPCR Master Mix (Roche, Switzerland) 10 μl, dH2O 5.5 μl, sense primer 10 pmol 0.5 μl, antisense primer 10 pmol 0.5 μl, probe 10 pmol 0.5μl, 추출한 DNA template 3 μl로 total 20 μl를 PCR tube에 넣은 후, 혼합액을 thermal cycler (7500 Real Time PCR system, Applied Biosystems)에서 증폭하였으며 음성대조군으로 멸균수와 형질전환시에 사용한 동진에서 추출한 DNA를 이용하였고, 양성 대조군으로 이미 검증된 형질전환체 T2 homo 계통과 T2 hetero 계통의 DNA를 이용하였다.
- 증폭된 DNA 밴드는 HiYield™Gel/PCR DNA Extraction Kit (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)를 이용하여 정제하였으며 LB 2 또는 RB 2 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열 정보는 RAP-DB program과 NCBI의 Blast 프로그램(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/)을 이용하여 분석되었다.
- 이차 PCR은 일차 PCR 생성물 1 μl을 주형으로 하여 AP2와 LB 2 또는 RB 2 primer를 사용하여 94°C에서 5 분간 전 처리 한 후 94°C에서 30 초, 60°C에서 30 초, 72°C에서 1분 30초간을 반응주기로 전체 40 회 반복 반응시킨 후 72°C에서 10 분간 최종 증폭하여 진행하였다.
- 일차 PCR 반응조건은 95°C에서 5 분간 전 처리한 후, 94°C에서 30 초, 67°C에서 1 분, 72°C에서 1 분간을 기본주기로 하여 총 20 회 반복 반응하고 72°C에서 10 분간 최종 증폭시켰다.
- 50 ng의 total DNA를 5 U의 Bfa I 제한효소로 완전절단 시킨 뒤 5 U의 T4 DNA ligase (England Biolabs)과 1 pmol의 adaptor DNA를 첨가하여 25°C에서 16 h 반응시켜 두 단계의 PCR을 수행하였다.
- Threshold cycle (Ct) 값에 의한 발현양 분석은 2−∆∆Ct으로 계산하였으며, ∆∆Ct은 처리식물체의(Ct target gene− Ct actin gene) − 대조식물체의(Ct target gene− Ct actin gene)에 의해 계산하여 수치화 하였다(Livak & Schmittgen 2001).
- PCR 반응은 94°C에서 4분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 1 분간 denaturation, 55°C에서 1 분간 annealing, 72°C에서 2 분간 extension 과정을 35 cycles로 하였으며, 마지막으로 72°C에서 10 분간 extension을 실시하였다.
- 합성된 cDNA 2 μl를 주형으로 하여 10×PCR buffer (200 mM Tris-HCl pH 8.4, 500 mM KCl) 5 μl와 50 mM MgCl2 1.5 μl, 10 mM dNTP mix 1 μl, Taq DNA polymerase (5 units/μl) 0.4 μl, forward primer (10 μM), reverse primer (10 μM)를 각각 1 μl씩 첨가하고 멸균수 38.1 μl로 최종 부피 50μl로 하여 PCR 분석을 행하였다.
- TaqMan probe PCR 반응 조건은 95°C에서 10 분간 predenaturation 시킨 후, 95°C에서 20 초 denuaturation, 56°C에서 1 분 annealing 을 40 회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 Quencher로 부터 분리된 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 fluorescence를 탐지하고 처음 탐지된 cycle 수(ct)는 amplification plots로 표현하였다.
- 이때 사용한 Bar 유전자 프라이머는 forward 5'-CGTCAACCACTACATCGAGA-3', reverse 5'-AAGTCCAGCTCGCAGAAA-3'로 제작하였고, PGD1 promoter forward 프라이머는 5'-TAGCTCTTAAC TTGCATGTC-3', OsASA2 유전자 프라이머는 forward: 5'- ATGGAGTCCATCGCCGCCGCCA-3', reverse: 5'-AGAGGTTTGAGAGGCGAAC-3'로 제작하여 95°C에서 6분간 pre- denaturation 시킨 후, 94°C에서 30 초간 denaturation, 58°C에서 30 초간 annealing, 72°C에서 1 분간 extension 과정을 30 cycles하였으며, 마지막으로 72°C에서 5 분간 extension을 실시하여 분석하였다. 또한 형질전환 각 세대에서 Single copy로 도입된 개체를 효율적으로 선발하기 위해 TaqMan PCR에 의해 유전자를 증폭하였다. TaqMan probe real-time PCR을 위하여 2 × Brilliant ∥ QPCR Master Mix (Roche, Switzerland) 10 μl, dH2O 5.
- TaqMan probe PCR 반응 조건은 95°C에서 10 분간 predenaturation 시킨 후, 95°C에서 20 초 denuaturation, 56°C에서 1 분 annealing 을 40 회 반복 실시하였고, annealing 반응 중에 Quencher로 부터 분리된 fluorescein FAM이 활성화 될 때마다 fluorescence를 탐지하고 처음 탐지된 cycle 수(ct)는 amplification plots로 표현하였다. TaqMan probe real-time PCR 검사로 복제된 증폭산물은 nos terminator의 특이적인 labeling한 probe primer를 이용하여 분석되었다. OsASA2 유전자가 도입된 형질전환체의 발현량 분석은 total RNA의 분리와 cDNA합성을 통하여 RT-PCR 및 qRT-PCR 분석을 수행하였다.
- TaqMan probe real-time PCR 검사로 복제된 증폭산물은 nos terminator의 특이적인 labeling한 probe primer를 이용하여 분석되었다. OsASA2 유전자가 도입된 형질전환체의 발현량 분석은 total RNA의 분리와 cDNA합성을 통하여 RT-PCR 및 qRT-PCR 분석을 수행하였다. 이때 사용한 actin primer set는 forward 5’-ATGGTTGGGATGGGTCAAAAA-3’, reverse 5’-TCTTTAATGTCACGGACGATT-3’와 같이 제작하였다.
- PCR 반응은 94°C에서 4분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 1 분간 denaturation, 55°C에서 1 분간 annealing, 72°C에서 2 분간 extension 과정을 35 cycles로 하였으며, 마지막으로 72°C에서 10 분간 extension을 실시하였다. PCR 산물은 1.5% agarose gel상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였다. qRT-PCR 분석은 합성한 cDNA 를 사용하여 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO co.
- 형질전환 벼에서 도입유전자의 삽입위치 확인은 Thole et al. (2009)이 보고한 adapter PCR 방법을 개량하여 사용하였다. 형질전환체 RB 인접서열 분석에 사용한 primer는 NCBI BLAST에서 Genome Survey Sequences Database 의 기존의 보고된 LB 인접서열의 유사성을 분석하여 수행한 결과 찾은 염기서열을 바탕으로 제작하였다.
- (2009)이 보고한 adapter PCR 방법을 개량하여 사용하였다. 형질전환체 RB 인접서열 분석에 사용한 primer는 NCBI BLAST에서 Genome Survey Sequences Database 의 기존의 보고된 LB 인접서열의 유사성을 분석하여 수행한 결과 찾은 염기서열을 바탕으로 제작하였다. 50 ng의 total DNA를 5 U의 Bfa I 제한효소로 완전절단 시킨 뒤 5 U의 T4 DNA ligase (England Biolabs)과 1 pmol의 adaptor DNA를 첨가하여 25°C에서 16 h 반응시켜 두 단계의 PCR을 수행하였다.
- 이차 PCR은 일차 PCR 생성물 1 μl을 주형으로 하여 AP2와 LB 2 또는 RB 2 primer를 사용하여 94°C에서 5 분간 전 처리 한 후 94°C에서 30 초, 60°C에서 30 초, 72°C에서 1분 30초간을 반응주기로 전체 40 회 반복 반응시킨 후 72°C에서 10 분간 최종 증폭하여 진행하였다. 증폭된 PCR 반응산물은 1% agarose gel에 전기영동 하여 ethidium bromide로 10 분간 염색하여 band를 확인하였다. 증폭된 DNA 밴드는 HiYield™Gel/PCR DNA Extraction Kit (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan)를 이용하여 정제하였으며 LB 2 또는 RB 2 primer를 이용하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열 정보는 RAP-DB program과 NCBI의 Blast 프로그램(http://blast.
- 20mM HCl (pH 2.2) 용액을 사용하여 5 ml로 정용한 다음, 0.45 μm membrane filter로 여과하고 여액을 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용해 유도체화시킨 후, HPLC 용 분석 시료로 사용하였다.
- 벼의 tryptophan (Trp) 합성계 중에서 feedback inhibition에 작용하는 key enzyme인 anthranilate synthase (AS) α subunit 관련 유전자중에 하나인 OsASA2를 5MT 저항성 돌연변이 계통으로부터 분리하고 동진 벼에 도입하여 형질전환 벼를 작성하였다.
- 목적 cRNA probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Rice 4 X 44K Oligo microarray을 사용하였고, hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용 각 spot의 nomalization을 수행하였다.
- 형질전환체에 의한 transcript의 발현양상을 규명하기 위해 대조구인 동진벼와 형질전환계통 TG1과 TG2를 50 ppm 5MT가 함유된 MS 배지에서 3 주간 배양하였다. 각각의 계통에서 5MT 처리구와 무처리구로부터 RNA를 추출한 후, microarray 분석을 2 반복으로 수행하여 발현 차이를 분석하였다.
- 형질전환체에 의한 transcript의 발현양상을 규명하기 위해 대조구인 동진벼와 형질전환계통 TG1과 TG2를 50 ppm 5MT가 함유된 MS 배지에서 3 주간 배양하였다. 각각의 계통에서 5MT 처리구와 무처리구로부터 RNA를 추출한 후, microarray 분석을 2 반복으로 수행하여 발현 차이를 분석하였다. 목적 cRNA probes와 hybridization은 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit (Agilent Technology, USA)을 사용하였으며, Microarray 분석을 위한 chip은 상용화 되고 있는 Agilent Rice 4 X 44K Oligo microarray을 사용하였고, hybridization 후, image quantification은 GenePix Pro 4.
- 1A). Feedback inhibition이 둔감한 고함량 트립토판 생산 형질전환 캘러스 및 식물체의 선발을 위해서 F124V single mutation 유전자와 S126F/ L530D double mutations 유전자를 각각 CaMV 35S 프로모터에 의해 제어되는 Bar 유전자가 삽입된 식물 발현 벡터인 pPGD1을 이용하여 벼에 도입하였다(Fig. 1A). 벼의 형질전환은 캘러스 115 개 중에서 총 35 개의 형질전환 식물체를 얻어 높은 효율을 보였다(Fig.
- 1B). 형질전환실험에서 얻어진 재분화 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에서 OsASA2 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해, 재분화된 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 도입한 F124V single mutation 유전자와 S126F/L530D double mutations 유전자로부터 얻어진 각각 10 개의 재분화 식물체에서 Bar 및 OsASA2 유전자가 검출되었다(Fig.
- 2A). Single copy로 도입된 T0 형질전환체로부터 Intergenic 개체를 선발하여 안정적으로 도입된 GM 개체들을 육성하기 위하여 FST분석을 수행하였다(Fig. 2B). OsASA2 유전자 영역 내 F124V 와 S126F/L530D으로 점돌연변이된 유전자가 도입된 형질전환체의 LB와 RB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 각각의 도입 유전자가 Intergenic으로 확인된 식물체를 4개체 선발하였다.
- OsASA2 유전자가 도입된 T0세대 및 T1, T2 세대 분석을 통해 유전자가 벼 게놈에 잘 도입되어 안정적으로 발현되는 개체들을 선발하여 single copy를 가지고 호모 계통이면서 intergenic인 형질전환체를 오창 생명공학 연구소 GMO포장(T1세대)과 충북대학교 GMO 포장(T2세대 및 T3세대)에 계통별로 파종하여 수확하였다. 형질전환 이벤트 T4 세대 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에서 OsASA2 유전자의 도입을 확인하고 유전자 발현 양상을 살펴 보았다(Fig.
- 세대)에 계통별로 파종하여 수확하였다. 형질전환 이벤트 T4 세대 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에서 OsASA2 유전자의 도입을 확인하고 유전자 발현 양상을 살펴 보았다(Fig. 3). 먼저 유전자 도입확인은 T3 식물체로부터 종자를 얻어 계통당 20 개씩 종자를 파종하고, 발아시킨 후, 14일경에 4 ppm의 Bastar 처리를 통해 저항성을 보인 식물체를 이용하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다.
- 3). 먼저 유전자 도입확인은 T3 식물체로부터 종자를 얻어 계통당 20 개씩 종자를 파종하고, 발아시킨 후, 14일경에 4 ppm의 Bastar 처리를 통해 저항성을 보인 식물체를 이용하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과 OsASA2의 F124V single (S-TG) 및 S126F/L530D double mutations (D-TG) 유전자가 도입된 형질전환 후대에서 Bar 및 OsASA2 유전자가 검출되어 OsASA2 유전자가 벼 게놈에 도입되어 후대에 잘 전이되고 있음을 확인하였다 (Fig.
- 3C). 형질전환체의 농업 형질분석은 출수 일수, 간장, 수장, 분얼수, 임실율, 임실/식물체, 종자건물중/30식물체, 화분임성, 1000립중 등을 조사하였다. 출수 일수는 100일 정도, 간장은 78-81 cm, 수장은 18-20 cm 등 야생종인 동진벼와 유전자가 제외되고 벡터만 도입된 Mock 등과 거의 유사한 결과를 얻었다(Fig.
- 고함량 Trp 종자는 정상적으로 발아와 생장을 하고 임성을가지고 있었다. 이들 식물체 중 아미노산 함량이 가장 높은 계통을 이용하여 80% 아세톤에서 추출해, 추출물을 역상계의 고체 카트리지를 사용하여 정제한 뒤 LC/MS 분석를 수행하였다. Single 돌연변이 유전자 도입 형질전환체(S-TG)와 double 돌연변이 유전자도입 형질전환체(D-TG)의 Trp, IAN 및 IAA 함량을 뿌리, 줄기, 잎으로 나누어 측정한 결과 형질전환체의 모든 부위에서 Trp의 함량이 높게 나타났으며, 특히 leaf 3에서는 대조구에 비해 월등히 높게 나타났다(Fig.
- 본 연구에서 OASA2유전자가 도입된 형질전환체는 Trp과 IAA 함량이 대조구에 비해 높게 나타난 것으로 보아 Trp의 축적량은 생화학적인 효소 기능을 반영하고 있음이 명백하며, 효소의 피드백 저해의 강약의 차이를 이용해 세포 내에 Trp 축적 농도를 어느 정도 제어한다는 것을 알 수 있었다. 또한 벼의 Trp 생합성 경로 상류에 위치한 chorismate 경로에 관련된 효소들의 기본 유전자 중에서 특히 대사 제어에 중요하다고 추정한 DAHP합성 효소 4 종류, chorismate kinase 3 종류, EPSP합성 효소 1 종류에 대해서 단백질 합성을 하고 효소 등 기본 기능 해석을 실시하였다. Chorismate kinase는 방향족 아미노산 및 관련 화합물의 생합성에 중요하며, 탄닌 등의 이차 대사물의 전구체 역할도 한다(Bartel 1997; Bender and Fink 1998).
- Anthranilate synthase (AS)는 트립토판(Trp)과 indole-3- acetic acid, indole alkaloids의 생합성 경로에서 중요한 효소로 작용한다. 트립토판 생합성 상에서 feedback inhibition에 민감하게 반응하는 AS alpha-subunit 관련 OASA2 유전자 영역의 single (F124V) 및 double (S126F/L530D) 점돌연변이로 변형된 유전자의 재조합운반체를 작성하고 이들 유전자들을 Agrobacterium 방법으로 동진벼에 도입하여 형질전환체를 육성하였다. Single 및 double 돌연변이 OsASA2 유전자가 도입된 형질전환벼 계통들은 nos gene probe를 이용한 TaqMan PCR 방법으로 single copy를 선발하였고, intergenic 계통을 선발하기 위해서 Bfa I 제한효소를 이용하여 RB와 LB 인접서열로부터 IPCR을 통한 FST 분석을 수행하여 4 개의 intergenic 계통을 선발하였다.
- 트립토판 생합성 상에서 feedback inhibition에 민감하게 반응하는 AS alpha-subunit 관련 OASA2 유전자 영역의 single (F124V) 및 double (S126F/L530D) 점돌연변이로 변형된 유전자의 재조합운반체를 작성하고 이들 유전자들을 Agrobacterium 방법으로 동진벼에 도입하여 형질전환체를 육성하였다. Single 및 double 돌연변이 OsASA2 유전자가 도입된 형질전환벼 계통들은 nos gene probe를 이용한 TaqMan PCR 방법으로 single copy를 선발하였고, intergenic 계통을 선발하기 위해서 Bfa I 제한효소를 이용하여 RB와 LB 인접서열로부터 IPCR을 통한 FST 분석을 수행하여 4 개의 intergenic 계통을 선발하였다. 도입된 유전자의 발현으로 형질전환 벼는 Trp, IAN 및 IAA가 잎에 가장 많이 축적되었고, 종자의 트립토판 함량도 증가되었다.
- 이때 사용한 Bar 유전자 프라이머는 forward 5'-CGTCAACCACTACATCGAGA-3', reverse 5'-AAGTCCAGCTCGCAGAAA-3'로 제작하였고, PGD1 promoter forward 프라이머는 5'-TAGCTCTTAAC TTGCATGTC-3', OsASA2 유전자 프라이머는 forward: 5'- ATGGAGTCCATCGCCGCCGCCA-3', reverse: 5'-AGAGGTTTGAGAGGCGAAC-3'로 제작하여 95°C에서 6분간 pre- denaturation 시킨 후, 94°C에서 30 초간 denaturation, 58°C에서 30 초간 annealing, 72°C에서 1 분간 extension 과정을 30 cycles하였으며, 마지막으로 72°C에서 5 분간 extension을 실시하여 분석하였다.
대상 데이터
- 5-Methyltryptophan (5MT) 저항성 벼 계통의 선발과 육성은 벼 품종으로부터 EMS 처리에 의해 유도된 6개의 5MT 저항성 벼 계통의 종자를 tryptophan analog인 5-Methyltryptophan 50 mg/L를 포함한 1/2 MS 배지와 5MT를 포함하지 않은 배지에 각각 파종하여 14일간 생육시킨 후 강한 저항성을 보이는 벼 계통을 선발하여 연구의 재료로 사용하였다. 선발된 개체로부터 유전자를 분리하고 염기서열 분석을 수행한 결과 OsASA2 (anthranilate synthase) 유전자의 124번째 아미노산인 TTC (phenylalanine)가 GTC (Valine)으로 변이된 개체(F124V)와 126번째 아미노산인 TCC (Serine)가 TTC (phenylalanine)로 변이되고, 530번째 아미노산인 CTT (Leucine)가 GAC (aspartic acid)로 변이된 개체(S126F/L530D)를 확인할 수 있었다(data not shown).
- 2B). OsASA2 유전자 영역 내 F124V 와 S126F/L530D으로 점돌연변이된 유전자가 도입된 형질전환체의 LB와 RB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 각각의 도입 유전자가 Intergenic으로 확인된 식물체를 4개체 선발하였다. 이들 식물체는 염색체 Os03g031100에서 9,988 bp (single #1), Os07g041022에서 26,820 bp (single #2), Os03g0204300에서 220 bp (double #1), Os01g0102100에서 5,820 bp (double #2) 떨어진 곳에 안정적으로 삽입된 것을 확인하였다(Fig.
- OsASA2의 도입에 의한 유리 Trp 함량이 증가한 벼 호모 계통인 T3세대를 육성했다. 이 종자의 유리 Trp 함량은 비 재조합에 비해 10 ~ 30배 이상 증가했고, 벼 종자 단백질의 프로모터에 의한 발현을 제어한 계통에서는 종자의 건물중의 차이는 약 0.
- 벼 형질전환체 중에서 얻어진 이벤트 계통 TG1 (S1) 및 TG2 (D1)의 T4 종자를 발아시킨 후, 24일 유묘를 microarray 분석을 위한 시료로 사용하었다. Microarray 결과를 바탕으로 data mining을 수행하여 transcript 발현 양상의 차이를 살펴본 결과 Table 2 및 Table 3과 같다.
데이터처리
- 0을 사용하였고, LOWESS 프로그램을 이용 각 spot의 nomalization을 수행하였다. 분석 프로그램은 Agilent GeneSpringGX 7.3을 사용하였으며, Hybridization은 각각 2 반복으로 수행하였다.
이론/모형
- Total RNA는 RNase H-Reverse Transcriptase (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) protocol에 따라 수행하였으며, first strand cDNA는 total RNA 5 μg으로부터 합성하였다.
- 5% agarose gel상에 영동 한 후, ethidium bromide로 염색하여 band를 확인하였다. qRT-PCR 분석은 합성한 cDNA 를 사용하여 SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO co., Japan)를 사용하여 권장하는 방법에 의해 수행하였다. Threshold cycle (Ct) 값에 의한 발현양 분석은 2−∆∆Ct으로 계산하였으며, ∆∆Ct은 처리식물체의(Ct target gene− Ct actin gene) − 대조식물체의(Ct target gene− Ct actin gene)에 의해 계산하여 수치화 하였다(Livak & Schmittgen 2001).
성능/효과
- 5-Methyltryptophan (5MT) 저항성 벼 계통의 선발과 육성은 벼 품종으로부터 EMS 처리에 의해 유도된 6개의 5MT 저항성 벼 계통의 종자를 tryptophan analog인 5-Methyltryptophan 50 mg/L를 포함한 1/2 MS 배지와 5MT를 포함하지 않은 배지에 각각 파종하여 14일간 생육시킨 후 강한 저항성을 보이는 벼 계통을 선발하여 연구의 재료로 사용하였다. 선발된 개체로부터 유전자를 분리하고 염기서열 분석을 수행한 결과 OsASA2 (anthranilate synthase) 유전자의 124번째 아미노산인 TTC (phenylalanine)가 GTC (Valine)으로 변이된 개체(F124V)와 126번째 아미노산인 TCC (Serine)가 TTC (phenylalanine)로 변이되고, 530번째 아미노산인 CTT (Leucine)가 GAC (aspartic acid)로 변이된 개체(S126F/L530D)를 확인할 수 있었다(data not shown). 두 가지 유형의 점돌연변이가 발생한 OsASA2 유전자를 각각 single mutation (F124V)과 double mutation (S126F/L530D)이라고 명명하고 분리한 후 식물발현벡터에 도입하였다.
- 형질전환실험에서 얻어진 재분화 식물체를 대상으로 벼 게놈 상에서 OsASA2 유전자의 도입 여부를 확인하기 위해, 재분화된 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 도입한 F124V single mutation 유전자와 S126F/L530D double mutations 유전자로부터 얻어진 각각 10 개의 재분화 식물체에서 Bar 및 OsASA2 유전자가 검출되었다(Fig. 1C). 이는 OsASA2 유전자가 벼 게놈에 잘 도입되어 있음을 의미하여 이들 형질전환체는 T0 세대부터 계통번호를 부여 하였다.
- OsASA2 유전자 영역 내 F124V 와 S126F/L530D으로 점돌연변이된 유전자가 도입된 형질전환체의 LB와 RB 인접서열을 이용하여 FST 분석을 수행한 결과 각각의 도입 유전자가 Intergenic으로 확인된 식물체를 4개체 선발하였다. 이들 식물체는 염색체 Os03g031100에서 9,988 bp (single #1), Os07g041022에서 26,820 bp (single #2), Os03g0204300에서 220 bp (double #1), Os01g0102100에서 5,820 bp (double #2) 떨어진 곳에 안정적으로 삽입된 것을 확인하였다(Fig. 2 B).
- 먼저 유전자 도입확인은 T3 식물체로부터 종자를 얻어 계통당 20 개씩 종자를 파종하고, 발아시킨 후, 14일경에 4 ppm의 Bastar 처리를 통해 저항성을 보인 식물체를 이용하여 도입유전자 Bar 및 OsASA2 유전자 특이 증폭용 primer set를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과 OsASA2의 F124V single (S-TG) 및 S126F/L530D double mutations (D-TG) 유전자가 도입된 형질전환 후대에서 Bar 및 OsASA2 유전자가 검출되어 OsASA2 유전자가 벼 게놈에 도입되어 후대에 잘 전이되고 있음을 확인하였다 (Fig. 3A). OsASA2 유전자가 도입된 형질전환체의 발현량 분석을 위해 RT-PCR 및 qRT-PCR법을 수행한 결과 형질전환체들 대부분에서 도입 유전자인 OsASA2의 F124V single 및 S126F/L530D double mutations 유전자가 세포 내에서 안정적으로 발현하고 있음을 확인하였다(Fig.
- 3A). OsASA2 유전자가 도입된 형질전환체의 발현량 분석을 위해 RT-PCR 및 qRT-PCR법을 수행한 결과 형질전환체들 대부분에서 도입 유전자인 OsASA2의 F124V single 및 S126F/L530D double mutations 유전자가 세포 내에서 안정적으로 발현하고 있음을 확인하였다(Fig. 3B). qRT-PCR법에 의한 OsASA2 유전자 발현을 정량한 결과를 대조구와 비교했을 때, WT과 Mock에 비하여 S-TG와 D-TG의 형질전환체에서 높게 발현하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 세대를 육성했다. 이 종자의 유리 Trp 함량은 비 재조합에 비해 10 ~ 30배 이상 증가했고, 벼 종자 단백질의 프로모터에 의한 발현을 제어한 계통에서는 종자의 건물중의 차이는 약 0.4%에 달했다. 고함량 Trp 종자는 정상적으로 발아와 생장을 하고 임성을가지고 있었다.
- 이들 식물체 중 아미노산 함량이 가장 높은 계통을 이용하여 80% 아세톤에서 추출해, 추출물을 역상계의 고체 카트리지를 사용하여 정제한 뒤 LC/MS 분석를 수행하였다. Single 돌연변이 유전자 도입 형질전환체(S-TG)와 double 돌연변이 유전자도입 형질전환체(D-TG)의 Trp, IAN 및 IAA 함량을 뿌리, 줄기, 잎으로 나누어 측정한 결과 형질전환체의 모든 부위에서 Trp의 함량이 높게 나타났으며, 특히 leaf 3에서는 대조구에 비해 월등히 높게 나타났다(Fig. 5). IAN 및 IAA함량은 거의 유사한 pattern을 보였다.
- 흥미롭게도 IAA의 식물 체내에 생합성 분포는 Trp 축적과 같은 경향을 나타내고 있었다. 또한 IAN도 이들 두 성분과 같은 추세로 증가하고 있으며, 축적하고 있는 IAA가 Trp 에서 IAN을 거쳐 생합성되고 있는 것으로 나타났다(Fig. 5A). 이와 같이 식물체내에 tryptophan 함량 증가가 tryptamine, serotonin, melatonin 및 gramine 등의 이차 대사산물의 변화가 일어난다고 하였다(Ueno et al.
- 2000). 본 연구에서 OASA2유전자가 도입된 형질전환체는 Trp과 IAA 함량이 대조구에 비해 높게 나타난 것으로 보아 Trp의 축적량은 생화학적인 효소 기능을 반영하고 있음이 명백하며, 효소의 피드백 저해의 강약의 차이를 이용해 세포 내에 Trp 축적 농도를 어느 정도 제어한다는 것을 알 수 있었다. 또한 벼의 Trp 생합성 경로 상류에 위치한 chorismate 경로에 관련된 효소들의 기본 유전자 중에서 특히 대사 제어에 중요하다고 추정한 DAHP합성 효소 4 종류, chorismate kinase 3 종류, EPSP합성 효소 1 종류에 대해서 단백질 합성을 하고 효소 등 기본 기능 해석을 실시하였다.
- Chorismate kinase는 방향족 아미노산 및 관련 화합물의 생합성에 중요하며, 탄닌 등의 이차 대사물의 전구체 역할도 한다(Bartel 1997; Bender and Fink 1998). 본 효소 발현 해석에서 S-GT, NIT1, ATR1 유전자에서 형질전환체들에서 발현차이를 보였다(Fig. 5B). 이런 결과는 식물체내에 tryptophan 함량이 높아져 IAA 함량 및 2차대사산물인 S-GT, NIT1, ATR1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현차이로 인해 기인된 것으로 사료된다.
- 형질전환 계통들 중 single copy로 도입되어 발현량이 높은 S-TG와 D-TG 이벤트 계통을 선발하여 유리 아미노산을 분석한 결과 유리아미노산의 총량은 대조구에 비해 S-TG는 3.8 배, D-TG는 4.1 배로 높게 나타났다. 특히 tryptophan은 대조구에 비하여 13 배에서 30 배 이상 높게 나타났으며, alanine, glycine, phenylalanine, threonine 및 serine 함량에서 대조구에 비해 4.
- 1 배로 높게 나타났다. 특히 tryptophan은 대조구에 비하여 13 배에서 30 배 이상 높게 나타났으며, alanine, glycine, phenylalanine, threonine 및 serine 함량에서 대조구에 비해 4.2, 4.0, 4.4, 3.0 및 3.0 배가 높게 나타났다(Fig. 6). 따라서 OsASA2 유전자를 과발현시키면, tryptophan 생합성회로상에서 feedback inhibition이 둔감하게 되어 아미노산함량이 전체적으로 높아지고, 특정 아미노산이 높은 결과를 초래함을 확인하였다.
- 6). 따라서 OsASA2 유전자를 과발현시키면, tryptophan 생합성회로상에서 feedback inhibition이 둔감하게 되어 아미노산함량이 전체적으로 높아지고, 특정 아미노산이 높은 결과를 초래함을 확인하였다.
- Single 및 double 돌연변이 OsASA2 유전자가 도입된 형질전환벼 계통들은 nos gene probe를 이용한 TaqMan PCR 방법으로 single copy를 선발하였고, intergenic 계통을 선발하기 위해서 Bfa I 제한효소를 이용하여 RB와 LB 인접서열로부터 IPCR을 통한 FST 분석을 수행하여 4 개의 intergenic 계통을 선발하였다. 도입된 유전자의 발현으로 형질전환 벼는 Trp, IAN 및 IAA가 잎에 가장 많이 축적되었고, 종자의 트립토판 함량도 증가되었다. 후대에서 tryptophan 함량이 높은 S-TG와 D-TG의 두 호모 이벤트 계통을 육성하여 트립토판 함량을 분석한 결과 대조구에 비하여 13~30배 이상 높게 나타났으며, 유리아미노산의 함량도 증가하였다.
- 도입된 유전자의 발현으로 형질전환 벼는 Trp, IAN 및 IAA가 잎에 가장 많이 축적되었고, 종자의 트립토판 함량도 증가되었다. 후대에서 tryptophan 함량이 높은 S-TG와 D-TG의 두 호모 이벤트 계통을 육성하여 트립토판 함량을 분석한 결과 대조구에 비하여 13~30배 이상 높게 나타났으며, 유리아미노산의 함량도 증가하였다. 이벤트 계통을 이용하여 microarray 분석을 수행한 결과 세포 내 이온 수송, 영양분 공급 등에 영향을 주는 유전자군들이 up-regulation 되었고, 세포 내 기능유전자의 역할을 담당하는 조효소 등이 down-regulation 된 것을 확인 할 수 있었다.
- 후대에서 tryptophan 함량이 높은 S-TG와 D-TG의 두 호모 이벤트 계통을 육성하여 트립토판 함량을 분석한 결과 대조구에 비하여 13~30배 이상 높게 나타났으며, 유리아미노산의 함량도 증가하였다. 이벤트 계통을 이용하여 microarray 분석을 수행한 결과 세포 내 이온 수송, 영양분 공급 등에 영향을 주는 유전자군들이 up-regulation 되었고, 세포 내 기능유전자의 역할을 담당하는 조효소 등이 down-regulation 된 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 선발된 두개의 상동성 이벤트 계통들이 고함량의 유리 트립토판 생산 벼의 육종에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준 결과로 생각된다.
- 이벤트 계통을 이용하여 microarray 분석을 수행한 결과 세포 내 이온 수송, 영양분 공급 등에 영향을 주는 유전자군들이 up-regulation 되었고, 세포 내 기능유전자의 역할을 담당하는 조효소 등이 down-regulation 된 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 선발된 두개의 상동성 이벤트 계통들이 고함량의 유리 트립토판 생산 벼의 육종에 효과적으로 이용될 수 있음을 보여준 결과로 생각된다.
- 3B). qRT-PCR법에 의한 OsASA2 유전자 발현을 정량한 결과를 대조구와 비교했을 때, WT과 Mock에 비하여 S-TG와 D-TG의 형질전환체에서 높게 발현하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 3C). 형질전환체의 농업 형질분석은 출수 일수, 간장, 수장, 분얼수, 임실율, 임실/식물체, 종자건물중/30식물체, 화분임성, 1000립중 등을 조사하였다.
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