본 연구는 약용 및 식용으로 유망한 음나무의 대량생산 및 생식질 보존을 위한 기초 자료를 제공하기 위해 배발생 조직을 재료로 저온저장 기간별 SE 유도 및 식물체 재생을 시험하였다. 배발생 캘러스는 저온저장 6개월까지 정상적인 체세포배 형성이 가능하였으나 유도 빈도는 저장 기간에 따라 감소하는 경향을 보였다. 배발생능이 가장 좋은 ZE 10 세포주은 체세포배 유도 빈도에 있어 저장 기간에 따른 감소폭이 비교적 적은 것으로 나타났다. 체세포배의 발아 및 식물체 재생은 캘러스의 저장기간에 따라 다소 감소하는 경향을 보였으나 발아율은 93% 이상, 식물체 재생율은 91% 이상으로 저온저장에 따른 큰 문제는 없었다. 조직검경 결과 저장 기간에 따라 세포의 갈변화 및 활력 저하가 나타났으며, 아세토카민과 에반스블루의 염색을 통해서도 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때 음나무 배발샐 캘러스의 저온저장은 계대배양 없이 $4^{\circ}C$의 냉장고에서 6개월 까지 가능한 것으로 나타났으며, 저장 후 체세포배 유도효율을 위해 배발생능이 양호한 세포주의 저장이 필요한 것으로 관찰되었다.
본 연구는 약용 및 식용으로 유망한 음나무의 대량생산 및 생식질 보존을 위한 기초 자료를 제공하기 위해 배발생 조직을 재료로 저온저장 기간별 SE 유도 및 식물체 재생을 시험하였다. 배발생 캘러스는 저온저장 6개월까지 정상적인 체세포배 형성이 가능하였으나 유도 빈도는 저장 기간에 따라 감소하는 경향을 보였다. 배발생능이 가장 좋은 ZE 10 세포주은 체세포배 유도 빈도에 있어 저장 기간에 따른 감소폭이 비교적 적은 것으로 나타났다. 체세포배의 발아 및 식물체 재생은 캘러스의 저장기간에 따라 다소 감소하는 경향을 보였으나 발아율은 93% 이상, 식물체 재생율은 91% 이상으로 저온저장에 따른 큰 문제는 없었다. 조직검경 결과 저장 기간에 따라 세포의 갈변화 및 활력 저하가 나타났으며, 아세토카민과 에반스블루의 염색을 통해서도 확인되었다. 이상의 결과로 볼 때 음나무 배발샐 캘러스의 저온저장은 계대배양 없이 $4^{\circ}C$의 냉장고에서 6개월 까지 가능한 것으로 나타났으며, 저장 후 체세포배 유도효율을 위해 배발생능이 양호한 세포주의 저장이 필요한 것으로 관찰되었다.
Somatic embryogenesis is as an excellent technology for potential use in plant mass production, germplasm conservation, or genetic engineering. We examined the effect of cold storage using 3 embryogenic callus lines with different levels of embryogenesis competence derived from immature zygotic embr...
Somatic embryogenesis is as an excellent technology for potential use in plant mass production, germplasm conservation, or genetic engineering. We examined the effect of cold storage using 3 embryogenic callus lines with different levels of embryogenesis competence derived from immature zygotic embryo cultures of Kalopanax setemlobus. Somatic embryo induction, germination and plant conversion were evaluated after 1, 3 and 6 months storage at $4^{\circ}C$ in the dark. Most cold-stored embryogenic calli formed somatic embryos normally even after 6 months; however, the induction rate was gradually decreased by increasing the storage period. The most competent line tended to show a slight decline in somatic embryo induction rate, as compared with other lines after cold storage. In general, cold storage resulted in reduced somatic embryo germination and plant regeneration, although 93% somatic embryo germination and 91% plant conversion were achieved regardless of the storage period. Cold storage led to cell browning and degradation. Additionally, the cell structures were confirmed by the aceto-carmine and evans blue dye evaluation. Collectively, our results showed that embryogenic callus of K. septemlobus could be preserved at $4^{\circ}C$ without subculture for 6 months, and suggested the need for storage of relatively more competent embryogenic calli lines to support somatic embryo induction.
Somatic embryogenesis is as an excellent technology for potential use in plant mass production, germplasm conservation, or genetic engineering. We examined the effect of cold storage using 3 embryogenic callus lines with different levels of embryogenesis competence derived from immature zygotic embryo cultures of Kalopanax setemlobus. Somatic embryo induction, germination and plant conversion were evaluated after 1, 3 and 6 months storage at $4^{\circ}C$ in the dark. Most cold-stored embryogenic calli formed somatic embryos normally even after 6 months; however, the induction rate was gradually decreased by increasing the storage period. The most competent line tended to show a slight decline in somatic embryo induction rate, as compared with other lines after cold storage. In general, cold storage resulted in reduced somatic embryo germination and plant regeneration, although 93% somatic embryo germination and 91% plant conversion were achieved regardless of the storage period. Cold storage led to cell browning and degradation. Additionally, the cell structures were confirmed by the aceto-carmine and evans blue dye evaluation. Collectively, our results showed that embryogenic callus of K. septemlobus could be preserved at $4^{\circ}C$ without subculture for 6 months, and suggested the need for storage of relatively more competent embryogenic calli lines to support somatic embryo induction.
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문제 정의
음나무 조직배양체의 토양이식은 주로 봄철의 시업 시기에 맞추어 수행되므로 배양체를 일정기간 저온저장하였다가 적정한 시업시기에 묘목을 생산한다면 경비절감등 여러 가지 측면에서 장점이 있을 것이다. 본 연구는 음나무의 3개 세포주의 배발생 캘러스를 재료로 4℃의 일반 냉장고에서 암배양 조건으로 저온저장 기간에 따른 발아 및 식물체 재생에 미치는 요인을 검토하고자 수행하였다.
제안 방법
침투 과정은 Ethyl alcohol: Infiltration sol. (500 ml Liquid Hardener I + 5 g activator)을 2:1, 1:1, 1:2로 교체한 후 각 단계마다 4℃에서 24시간 동안 처리하였다. 경화는 Technovit 7100 (kulzer)을 사용하여 Infiltration sol.
건조를 방지하기 위하여 폴리에틸렌 지퍼백에 넣어 플라스틱 용기(535 x 370 x 170 mm)에 담아 암 저장하였다. 0, 1, 3, 6개월간 각각 저장하였으며 저장 기간별로 캘러스를 꺼내어 체세 포배 유도를 시험하였다.
0.1% Periodic acid 염색액에 30분, Schiff’s 염색액에 30분, 0.05% TBO 염색액에 25분 염색 후 실체현미경 하에서 관찰하였다.
순화실은 조명 20 µmol m-2 s-1, (16시간 광주기), 온도 25±2℃로 유지하였다. 4주 후에 생존율을 조사하였다.
0 mg/L GA3 처리 혹은 기본배지를 사용하였다. 4주간 배양 후 뿌리가 자라고 자엽이 형성된 것을 발아(germination)된 것으로, 그다음 정아의 신초가 생장하고 본엽이 자라는 것을 재생(conversion)된 것으로 조사하였다. 처리 당 10 plates로 3 반복을 두었고, 배양은 체세포배 유도와 동일한 조건으로 수행하였다.
체세포배의 발아 및 재생은 비교적 동일한 발달단계의 어뢰형 배를 선발하여 시험하였다. 발아용 배지는 1/2MS배지(2% sucrose, 0.3% gelrite 첨가)를 사용하였고, 발아 촉진을 위해 1.0 mg/L GA3 처리 혹은 기본배지를 사용하였다. 4주간 배양 후 뿌리가 자라고 자엽이 형성된 것을 발아(germination)된 것으로, 그다음 정아의 신초가 생장하고 본엽이 자라는 것을 재생(conversion)된 것으로 조사하였다.
배발생 세포주 15개를 유도하였는데 그중에서 체세포배발생능이 가장 좋은 세포주(ZE 10), 보통인 세포주(ZE 6), 가장 저조한 세포주(ZE 15)의 3개 세포주를 본 시험에 사용하였다. 배발생 캘러스의 저장은 MS배지(Murashige and Skoog 1962)에 1.0 mg/L 2,4-D, 1 g/L L-glutamine, 4% sucrose를 첨가하고 0.3% gelrite로 경화하여 사용하였다. 약 0.
배양은 냉백색 형광등(FL 40D, 40W, OSRAM) 하에서 1일 16시간 조명(40 μm m-2 s-1), 온도는 25±2℃로 유지되는 배양실에서 실시하였다.
약 0.5 g의 배발생 캘러스를 1회용 샤레(90 x 15 mm, SPL, Korea)에 각각 plating하여 3주간 배양 후 유니랩으로 밀봉하여 4±0.4℃의 냉장고에 저온 저장하였다.
다음 알콜 램프로 수초 간 가열하고, 약 1분 후에 스포이드를 이용 1/2 MS 액체배지로 세척하였다. 여기에 0.05% 에반스블루를 같은 방법으로 염색하고 액체 배지로 씻은 다음 실체현미경 하에서 관찰하였다.
체세포배 유도는 4~6주간 실시하였고, 실체현미경(Leica M205 C, Wetzlar, Germany) 하에서 주기적으로 관찰하였다. 처리 당 10 plates로 3 반복으로 실험하였다. 배양은 냉백색 형광등(FL 40D, 40W, OSRAM) 하에서 1일 16시간 조명(40 μm m-2 s-1), 온도는 25±2℃로 유지되는 배양실에서 실시하였다.
4주간 배양 후 뿌리가 자라고 자엽이 형성된 것을 발아(germination)된 것으로, 그다음 정아의 신초가 생장하고 본엽이 자라는 것을 재생(conversion)된 것으로 조사하였다. 처리 당 10 plates로 3 반복을 두었고, 배양은 체세포배 유도와 동일한 조건으로 수행하였다.
체세포배 유도는 1/2 MS배지에 0.1 mg/L abscisic acid (ABA), 7% polyethylene glycol (PEG), 0.02% activated charcoal, 3% sucrose를 첨가하고, 0.5% gelrite로 경화하여 사용하였다. 대조구로는 배양실의 상온에서 유지하고 있는 배발생캘러스를 사용하였다.
대조구로는 배양실의 상온에서 유지하고 있는 배발생캘러스를 사용하였다. 체세포배 유도는 4~6주간 실시하였고, 실체현미경(Leica M205 C, Wetzlar, Germany) 하에서 주기적으로 관찰하였다. 처리 당 10 plates로 3 반복으로 실험하였다.
체세포배의 발아 및 재생은 비교적 동일한 발달단계의 어뢰형 배를 선발하여 시험하였다. 발아용 배지는 1/2MS배지(2% sucrose, 0.
8로, 24 ~ 48시간 동안 침지시켜 고정시켰다. 탈수는 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100% 에탄올로 단계별로 침지시킨 후, 각 단계마다 샘플이 공기 중에 노출되지 않도록 스포이트를 이용해 알코올을 바꿔주었다. 그다음 60 cmHg, 30분 동안 진공상태로 만들고, 상온에서 3시간 동안 침지시켰다.
대상 데이터
5% gelrite로 경화하여 사용하였다. 대조구로는 배양실의 상온에서 유지하고 있는 배발생캘러스를 사용하였다. 체세포배 유도는 4~6주간 실시하였고, 실체현미경(Leica M205 C, Wetzlar, Germany) 하에서 주기적으로 관찰하였다.
6A). 배발생 세포주 15개를 유도하였는데 그중에서 체세포배발생능이 가장 좋은 세포주(ZE 10), 보통인 세포주(ZE 6), 가장 저조한 세포주(ZE 15)의 3개 세포주를 본 시험에 사용하였다. 배발생 캘러스의 저장은 MS배지(Murashige and Skoog 1962)에 1.
기내에서 재생된 약 5 cm 자란 어린 식물체를 피트모스와 펄라이트가 혼합된 상토(1:1, v/v)에 이식하여 순화하였다. 상토는 원예 삽목용 플라스틱 상자(50 x 30 cm)에 2/3 정도 상토를 채워서 사용하였다. 순화실은 조명 20 µmol m-2 s-1, (16시간 광주기), 온도 25±2℃로 유지하였다.
데이터처리
모든 측정값은 5회 반복하여 평균값과 표준편차(mean±SD)를 표시하였고 통계 분석은 SPSS 프로그램(SPSS Inc., Chicago, USA)을 사용하였으며 Duncan 다중검정(DMRT) 및 t-test로 유의성 검정을 하였다.
이론/모형
체세포 배발생 캘러스는 2011년 8월에 성숙 음나무에서 채취한 미숙종자로부터 Moon et al. (2005, 2008)의 방법으로 유도하였다(Fig. 6A). 배발생 세포주 15개를 유도하였는데 그중에서 체세포배발생능이 가장 좋은 세포주(ZE 10), 보통인 세포주(ZE 6), 가장 저조한 세포주(ZE 15)의 3개 세포주를 본 시험에 사용하였다.
성능/효과
4와 6 E와 같다. 4주 후의 생존율은 대조구 비해 다소 낮았으나, 세포주에 따라 88 ~ 90%의 생존율을 보였다. 이 같은 결과는 GA3처리로 재생된 식물체에서도 유사하게 관찰되었다.
2001; Mauri and Manzanera 2004). 결과적으로 저온저장된 음나무 배발생 조직에서 체세포배 유도 및 식물체 재생은 대조구에 비해 유도 빈도가 다소 떨어지고 체세포배 유도에 걸리는 시간이 2주 정도 더 소요되었다. 앞으로 다양한 배발생 조직의 저온저장을 통한 시간 및 노동력의 절감 효과의 가능함을 보여 주었다.
이 같은 결과는 GA3처리로 재생된 식물체에서도 유사하게 관찰되었다. 따라서 음나무의 저온저장된 배발생 캘러스로부터 재생된 식물체의 순화율은 90% 내외로 나타났고 큰 어려움 없이 순화되었다.
2, 3 그리고 6 D와 같다. 발아율은 대조구(미 저온저장)에 비해 다소 저조하였으나 ZE 10은 95.6%, ZE 6은 92.1%, ZE 15는 92.6%로 세포주에 관계없이 높은 발아율을 보였다. 따라서 배발생 캘러스의 저온저장에 따른 문제는 크지 않은 것으로 나타났다.
어느 라인에서나 저온저장 기간이 길어지면서 SE 유도율이 감소하는 경향을 보였으며, 감소율은 세포주에 따라 다르게 나타났다. 배발생능이 가장 좋았던 ZE 10 세포주는 대조구(25℃)에 비해 1개월 후에는 약 18.8%, 3개월 후에는 29.9%, 6개월 후에는 47.7% 감소되었다. 이러한 경향은 보통의 배발생능의 ZE 6 세포주에서도 유사하게 나타나 1개월 후에는 32.
식물체 재생은 캘러스의 저온저장 기간이 길어지면서 다소 감소하는 경향을 보였으나 어느 세포주에서나 91% 이상 높은 식물체 재생율을 보였다. 배발생능이 가장 좋은 ZE 10은 6개월 저장 후에도 평균 94.3%의 재생율을 보인 반면 ZE 6과 ZE 15는 89.1%, 89.9%로 다소 감소하였다. GA3 처리에 따른 식물체 재생 효과는 배발생 세포주 및 저장기간에 따른 차이가 크지 않았다.
8%로 감소되었다. 한편 배발생능이 가장 저조한 ZE 15 세포주는 1개월 후 15.5%, 3개월 후 35.0%, 6개월 후 69.5%로 저장 기간에 따라 SE 유도율이 현저히 감소되었다.
후속연구
결과적으로 저온저장된 음나무 배발생 조직에서 체세포배 유도 및 식물체 재생은 대조구에 비해 유도 빈도가 다소 떨어지고 체세포배 유도에 걸리는 시간이 2주 정도 더 소요되었다. 앞으로 다양한 배발생 조직의 저온저장을 통한 시간 및 노동력의 절감 효과의 가능함을 보여 주었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
초저온저장의 단점은?
1987) 등에서 보고되었다. 초저온저장은 가장 이상적인 장기저장 방법이지만, 여러 가지 설비 및 예냉조건, 초저온보호제 등의 첨가가 요구되는 등 그 방법이 제한적이고 비용이 매우 비싸며(Park and Chae 1993), 냉동 보관 시 세포의 동결과 융해 시 세포의 손상 등 장애가 생길 수 있다는 단점이 있다(Richard et al. 1991).
음나무란?
음나무(Kalopanax septemlobus Koidz.)는 두릅나무과에 속하는 낙엽활엽 교목으로 목재는 물론 한약재 및 산채로도 이용되는 유망한 수종이다(Moon et al. 2008).
음나무의 산업적인 측면에서의 이용 가능성이 대두된 이유는?
2008). 최근에는 여러 종류의 Saponin 및 항산화 물질에 관한 연구(Shao et al. 1990; Porzel et al. 1992), 항류머티즘(Choi et al. 2002a, b), 항당뇨병(Park et al. 1998), 항염증성(Kim et al. 2002; Lee et al. 2001) 등의 약리적인 효과가 보고되어 산업적인 측면에서의 이용 가능성을 크게 하고 있다. 음나무의 조직배양은 기관형성과 체세포배 유도에 의한 대량증식 연구가 수행되었으나(Moon et al.
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