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문제 정의
- 그러므로 본 연구에서는 UV에 의한 산화적 스트레스로 초래되는 손상에 항산화 작용을 통하여 각질형성세포를 보호할 수 있는 기능성 소재 발굴의 일환으로 가감당귀음자를 이용하여 항산화 및 자외선에 대한 항노화 효능을 확인하는 실험을 진행하여 유의한 결과를 얻어 이에 보고하는 바이다.
- 따라서 본 연구에서는 가감당귀음자의 항산화능력을 확인하고, 사람각질형성세포에서 가감당귀음자가 자외선으로 유도된 세포사멸을 억제하는지 여부 및 사람각질형성세포에서 자외선 조사로 활성화되는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 미치는 영향을 규명함으로써 자외선으로 유도된 피부노화에 대한 가감당귀음자의 보호효과 및 그 기전을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- Oyaizu의 방법28)에 따라 가감당귀음자의 환원력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 1 ㎖에 pH 6.6의 200 mM 인산 완충액 및 1%의 potassium ferricyanide를 각 1 ㎖씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕상에서 20분 동안 반응시켰다. 여기에 10% TCA 용액을 1 ㎖ 가하여 13500 × g에서 15분 동안 원심분리 하고 상등액 1 ㎖에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ㎖를 혼합한 후 microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 700 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- Choi 등의 실험방법25)을 변형하여 hydrogen peroxide에 대한 가감당귀음자의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 각 80 ㎕를 20 ㎕의 10 mM hydrogen peroxide 및 100 ㎕의 0.01 M 인산완충용액(pH 5.0)과 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 그 후, 15 ㎕의 1.
- Brand-Williams 등의 실험방법23)을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 가감당귀음자의 소거능력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 500 ㎕를 1.
- Choi 등의 실험방법25)을 변형하여 hydrogen peroxide에 대한 가감당귀음자의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 각 80 ㎕를 20 ㎕의 10 mM hydrogen peroxide 및 100 ㎕의 0.
- Chung 등의 실험방법24)을 변형하여 hydroxyl radical에 대한 가감당귀음자의 소거능력을 측정하였다. 50 ㎕의 10 mM FeSO4와 50 ㎕의 10 mM H2O2를 이용한 Fenton 반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다.
- Shlafer 등의 실험방법27)을 변형하여 lipid peroxidation에 대한 가감당귀음자의 항산화 효과를 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 2 ㎕를 linolenic acid emulsion 98 ㎕와 혼합한 후에 0.
- UVB로 유도된 세포사멸을 초래하는 ROS의 활성에 대한 가감당귀음자의 효과를 확인하고자 DCFH-DA assay를 시행하여 세포내 ROS 변화를 측정 하였다. 형광표지자인 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)는 세포막을 쉽게 통과하여 세포 내에 확산된 후 세포 내의 에스테라아제에 의해 2',7'-dichlorohydrofluorescein(DCFH)로 가수분해 되면서 형광이 소실되는데, ROS가 존재하는 환경에서는 2',7'-dichlorofluorescein(DCF)로 빠르게 산화되면서 고형광을 발생한다2).
- 본 연구에서는 가감당귀음자의 항산화 효과 및 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호효과를 확인하고자 생체 내 산화적 스트레스를 유발하는 DPPH radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, superoxide radical, lipid peroxidation에 대한 가감당귀음자 열수추출물의 소거 효과 및 환원력 평가와 사람 각질형성세포주인 HaCaT cell에서 UVB로 유도된 세포사멸과 ROS 생성에 대한 가감당귀음자의 작용을 평가하는 실험을 진행하였다. 그 결과, 가감당귀음자는 다양한 활성산소종에 대한 항산화 효능이 있으며 세포내에서 UVB로 유도된 세포사멸의 발현을 억제하며 이는 가감당귀음자의 ROS 생성 억제 효과와 관련이 있음을 알 수 있었다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 HaCaT 세포주는 Cell Line Service(passage 32, Germany)에서 분양 받았으며, 세포주를 배양하기 위하여 사용된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM), Fetal Bovine Serum(FBS), penicillin/streptomycin, Trypsin-EDTA 그리고 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)는 Thermo Fisher Scientific Inc.(Gibco, USA)로부터 구입하였다. HaCaT 세포주를 배양하기 위하여 10% FBS와 100 unit/㎖ penicillin streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 가감당귀음자(Gagam-Danguieumja, GDE)의 한약재는 새롬제약(한국, 안성)에서 구입하였으며 세명대학교 부속한방병원에서 조제하였다(Table 1).
이론/모형
- Liu 등의 실험방법26)에 따라 superoxide radical에 대한 가감당귀음자의 소거활성을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 시료 각 20 ㎕에 62 uM nitro blue tetrazolium(NBT)와 98 μM β-nicotinamide adenine dinucleotide(NADH)를 함유한 20 mM Tris 용액(pH 8.
- Oyaizu의 방법28)에 따라 가감당귀음자의 환원력을 측정하였다. 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도의 가감당귀음자 열수추출물 1 ㎖에 pH 6.
- 가감당귀음자가 HaCaT 세포주의 생존율에 미치는 영향을 확인하고자 MTT assay를 실시하였다. 대조군의 평균 흡광도를 100으로 환산한 뒤 각 흡광도 값을 계산한 결과, 모든 농도에서 가감당귀음자 처리군은 대조군과 유의한 차이가 관찰되지 않았다.
성능/효과
- Hydroxyl radical은 구리, 철 이온 등의 금속이온과 반응하여 독성이 강한 free radical을 생성하는데 DNA 손상 및 돌연변이 유발로 인해 문제시 되고 있다37). 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 가감당귀음자를 처리한 후 hydroxyl radical 소거능을 측정한 결과, 농도 의존적 소거능 증가가 관찰되었다.
- UVB 조사로 증가된 세포내 ROS에 대한 가감당귀음자의 영향을 관찰하기 위하여 DCFH-DA assay를 시행한 결과, UVB의 자극은 세포 내 ROS의 생성을 현저히 증가시켰으며, 이러한 ROS의 생성은 가감당귀음자 처리에 의하여 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 형광표지자인 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCFH-DA)는 세포막을 쉽게 통과하여 세포 내에 확산된 후 세포 내의 에스테라아제에 의해 2',7'-dichlorohydrofluorescein(DCFH)로 가수분해 되면서 형광이 소실되는데, ROS가 존재하는 환경에서는 2',7'-dichlorofluorescein(DCF)로 빠르게 산화되면서 고형광을 발생한다2). UVB 조사를 통해 ROS를 유도한 후 200 ㎍/㎖의 가감당귀음자를 처리한 결과, 대조군의 ROS 생성량에 비하여 감소된 것을 확인함으로써 가감당귀음자가 ROS 생성을 억제하여 세포내 산화적 스트레스를 감소시켜 줌으로써 세포사멸을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl(DPPH)는 안정한 유리기로 cysteine, glutathion과 같은 황 함유 아미노산과 ascorbicacid, aromatic amine(ρ-phenylenediamine, ρ-aminophenol) 등에 의해 환원되어 자색이 탈색되므로 다양한 천연소재에서 항산화물질을 검출하는데 다용되고 있다23). 가감당귀음자는 25 ㎍/㎖의 농도에서 부터 대조군과 비교하여 유의성 있는 DPPH radical 소거능을 보였으며 농도 의존적으로 효과가 증대되었다.
- Hydrogen peroxide는 활성산소를 쉽게 생성하여 ROS에 포함되는데, 그 자체의 독성은 낮으나 세포막을 통과하고 Fe2+ 등과 같은 금속이온과 반응하여 독성이 강한 hydroxyl radical을 생성하기 때문에 생체나 식품에서 문제시 되고 있다38-40). 가감당귀음자는 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 대조군과 비교하여 유의성 있는 소거능을 나타내었으며 200 ㎍/㎖ 농도에서 vitamin C(17.06%)와 유사한 소거능(22.4%)을 보였다.
- 환원력은 항산화 과정에서 중요한 요소로서 항산화제로부터 제공되는 수소원자가 free radical과 반응28)하는 능력을 의미한다. 가감당귀음자의 환원력을 확인하기 위하여 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 농도 의존적으로 환원력이 증가됨을 관찰할 수 있었다.
- 본 연구에서는 가감당귀음자의 항산화 효과 및 자외선으로 유도된 각질형성세포 손상에 대한 보호효과를 확인하고자 생체 내 산화적 스트레스를 유발하는 DPPH radical, hydroxyl radical, hydrogen peroxide, superoxide radical, lipid peroxidation에 대한 가감당귀음자 열수추출물의 소거 효과 및 환원력 평가와 사람 각질형성세포주인 HaCaT cell에서 UVB로 유도된 세포사멸과 ROS 생성에 대한 가감당귀음자의 작용을 평가하는 실험을 진행하였다. 그 결과, 가감당귀음자는 다양한 활성산소종에 대한 항산화 효능이 있으며 세포내에서 UVB로 유도된 세포사멸의 발현을 억제하며 이는 가감당귀음자의 ROS 생성 억제 효과와 관련이 있음을 알 수 있었다.
- 4). 따라서 가감당귀음자는 UVB로 유도된 세포손상에 대하여 회복 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 사람각질형성세포인 HaCaT 세포주에 대한 UVB의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하여 세포 생존율을 측정한 결과 세포사멸 비율이 UVB 조사량에 비례하여 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 가감당귀음자를 처리한 경우, 세포사멸 비율이 가감당귀음자의 각 농도에 비례하여 현저하게 감소하였으며 Hoechst 33342 염색 후 형광 현미경 관찰을 통해서도 가감당귀음자가 세포사멸로 인한 apototic body 형성을 억제함을 확인할 수 있었다.
- Superoxide radical은 ROS 중 대표적인 산소라디칼로 dismutation 반응 후 hydrogen peroxide로 인하여 hydroxyl radical로 전환되는데, hydroxyl radical은 반응성이 커서 생체 내 거대분자를 손상시키고 산화형 철인 Fe3+를 환원형 철인 Fe2+로 환원시켜 fenton 반응을 유도하며, 단백질 구조를 직접 변형시켜 효소 불활성화를 초래하므로 superoxide radical 또한 인체 내 산화 및 발암과 밀접한 관계를 갖고 있다41-43). 본 실험에서 xanthine과 xanthine oxidase에 의해 생성되는 superoxide radical에 대한 가감당귀음자의 소거능을 평가한 결과 농도 의존적 소거능 증가를 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서 사람각질형성세포인 HaCaT 세포주에 대한 UVB의 세포독성을 측정하기 위해 MTT assay를 시행하여 세포 생존율을 측정한 결과 세포사멸 비율이 UVB 조사량에 비례하여 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 가감당귀음자를 처리한 경우, 세포사멸 비율이 가감당귀음자의 각 농도에 비례하여 현저하게 감소하였으며 Hoechst 33342 염색 후 형광 현미경 관찰을 통해서도 가감당귀음자가 세포사멸로 인한 apototic body 형성을 억제함을 확인할 수 있었다.
- 본 연구를 통해 가감당귀음자가 항산화능력을 바탕으로 UVB에 의한 ROS의 생성으로 유발된 세포사멸을 억제함으로써 자외선으로 인한 피부손상 보호효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 추후 항산화 효과가 우수한 식물종에 대해 단일 물질에 대한 분리 작업과 함께 항주름, 미백 효과에 대한 실험이 더 깊이 있게 진행된다면 새로운 천연물 유래 생리 활성 물질로서 효과적이면서도 안전한 화장품 소재로의 활용 또한 가능할 것으로 기대된다.
- Lipid peroxide(LPO)는 독성물질에 의한 세포막 지질성분의 산화반응 촉진으로 생성되는 산물로써 생체 내에서 생화학적 조직손상의 척도 및 조직의 산화적 손상에 의해 야기되는 병리현상의 척도로 널리 활용되고 있다44). 본 연구에서는 지질 과산화에 대한 가감당귀음자의 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton 반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시킨 후 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 가감당귀음자를 처리한 결과 25 ㎍/㎖ 농도에서부터 대조군과 비교하여 유의성 있는 지질과산화 억제효과를 나타내었다.
후속연구
- 피부 노화의 원인도 이러한 인체 노화의 원인과 동일하므로 精血의 虧虛로 인한 노화가 결국 피부 노화를 일으키는 근본원인이 될 것이다. 따라서 補陰補血 효능을 지닌 한방처방을 기본으로 피부 생리 활성 효능이 있는 한약재들을 가감한다면 안전하면서도 우수한 피부 항노화 효과를 지닌 한방피부미용 소재로의 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 가감당귀음자는 다양한 활성산소종을 억제하는 항산화능력을 지니고 있으므로 저활성 및 용도의 한계성 등으로 사용에 제한을 받는 기존 항산화제들42)의 문제점을 보완할 수 있는 한방처방으로써 피부를 비롯한 생체의 노화를 방지하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구를 통해 가감당귀음자가 항산화능력을 바탕으로 UVB에 의한 ROS의 생성으로 유발된 세포사멸을 억제함으로써 자외선으로 인한 피부손상 보호효과를 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 토대로 추후 항산화 효과가 우수한 식물종에 대해 단일 물질에 대한 분리 작업과 함께 항주름, 미백 효과에 대한 실험이 더 깊이 있게 진행된다면 새로운 천연물 유래 생리 활성 물질로서 효과적이면서도 안전한 화장품 소재로의 활용 또한 가능할 것으로 기대된다.
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