[논문]T24 인체방광암 세포에서 pachymic acid에 의한 apoptosis 유발

정진우; 백준영; 김광동; 최영현; 이재동

doi:10.5352/jls.2015.25.1.93

[국내논문] T24 인체방광암 세포에서 pachymic acid에 의한 apoptosis 유발
Induction of Apoptosis by Pachymic Acid in T24 Human Bladder Cancer Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.25 no.1 = no.177, 2015년, pp.93 - 100

정진우 (경상대학교 응용생명과학부(BK21 Plus)) , 백준영 (부산대학교 자연과학대학 미생물학과) , 김광동 (경상대학교 응용생명과학부(BK21 Plus)) , 최영현 (동의대학교 한의과대학 생화학교실) , 이재동 (부산대학교 자연과학대학 미생물학과)

초록
AI-Helper

Pachymic acid는 복령에서 분리된 lanostane-type인 triterpenoid의 일종이다. 최근 pachymic acid가 항암 및 항염증 효능과 산화적 스트레스에 대한 항산화 효능 등과 같은 약리적인 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있으나, 그에 대한 구체적인 분자생물학적 기전 연구는 매우 미비한 실정이다. 본 연구에서는 pachymic acid의 항암활성 및 관련 기전 조사의 일환으로 T24 인체 방광암세포 모델을 이용하여 pachymic acid에 의한 apoptosis 유발 여부를 검증하였다. 본 연구의 결과에 의하면 pachymic acid는 T24 세포의 증식을 유의적으로 억제시켰으며, 이는 apoptosis 유발과 연관성이 있음을 다양한 방법으로 확인하였다. Pachymic acid에 의한 apoptosis 유도에는 pro-apoptotic 인자들의 발현 증가와 anti-apoptotic 유전자 산물들의 발현 감소가 동반되었으며, MMP의 소실과 tBid의 발현 증가가 관찰되었다. 아울러 pachymic acid는 extrinsic 및 intrinsic apoptosis 경로의 개시에 관여하는 caspase-8 및 -9의 활성뿐 만 아니라, caspase-3의 활성도 증가시킴으로서 PARP와 같은 기질 단백질의 단편화를 초래하였다. 따라서 pachymic acid는 항암활성을 지니는 천연생리활성 물질로서의 잠재력이 매우 높음을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Pachymic acid (PA) is a lanostane-type triterpenoid derived from the Poria cocos mushroom. Several beneficial biological features of PA provide medicine with a wide variety of valuable effects, such as anticancer and anti-inflammatory activity; it also has antioxidant effects against oxidative stress. Nonetheless, the biological properties and mechanisms that produce this anti-cancer action of PA remain largely undetermined. In this study, we investigated the pro-apoptotic effects of PA in T24 human bladder cancer cells. It was found that PA could inhibit the cell growth of T24 cells in a dose-dependent manner, which was associated with the induction of apoptotic cell death, as evidenced by the formation of apoptotic bodies and chromatin condensation and accumulation of cells in the sub-G1 phase. The induction of apoptotic cell death by PA was connected with an up-regulation of pro-apoptotic Bax and Bad protein expression and down-regulation of anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-xL proteins, and inhibition of apoptosis family proteins. In addition, apoptosis-inducing concentrations of PA induced the activation of caspase-9, an initiator caspase of the mitochondrial-mediated intrinsic pathway, and caspase-3, accompanied by proteolytic degradation of poly (ADP-ribose)-polymerase. PA also induced apoptosis via a death receptor-mediated extrinsic pathway by caspase-8 activation, resulting in the truncation of Bid and suggesting the existence of cross-talk between the extrinsic and intrinsic pathways. Taken together, the present results suggest that PA may be a potential chemotherapeutic agent for the control of human bladder cancer cells.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

Extrinsic 및 intrinsic pathway의 활성화를 통한 apoptosis 유발에는 여러 종류의 caspase가 관여하는 것으로 알려져 있기에, pachymic acid 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 이들의 활성이 관여하는 지의 여부를 조사하였다. 먼저 caspase의 발현 정도를 확인한 결과, Fig.
하지만 이들 사이에 균형이 깨어지게 되면 mitochondria 내부로부터 세포질로 cytochrome c 등과 같은 apoptosis를 유발하는 물질들이 방출되어 cysteine-related proteases인 caspase 및 DNA의 단편화와 연관된 endonuclease 등의 활성이 증가되어 apoptosis가 유발된다[3, 21]. 따라서 본 연구에서는 pachymic acid 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과 pachymic acid 처리 농도 의존적으로 Bax, Bad 및 tBid 단백질의 발현 증가와 더불어 Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질의 발현 감소가 관찰되어(Fig.
따라서 본 연구에서는 복령 유래의 pachymic acid가 인체 방광암세포 T24에 미치는 항암 효과의 생화학적 기전의 해석을 위하여 T24 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하였고, pachymic acid가 유발하는 증식억제 현상이 apoptosis에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하여 유의적인 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바 이다.
본 연구에서는 다양한 약리학적 활성을 가지는 것으로 알려진 pachymic acid의 항암효능을 알아보기 위하여 인체 방광암세포주인 T24 세포의 생존율 및 증식 억제에 미치는 영향과 이와 연관된 apoptosis 유발 여부 및 관련 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 이를 위하여 먼저 pachymic acid의 처리에 따른 증식억제 정도를 조사한 결과, pachymic acid 처리 농도의존적으로 생존율 및 증식억제 현상이 나타났으며(Fig.
한편 활성화된 caspase는 세포의 정상적인 생존에 필수적인 세포 내 주요 단백질들을 분해할 수 있으며, 단편화가 일어난 이들 단백질들은 apoptosis가 유발되었다는 표지인자로서 활용이 된다. 본 연구에서는 대표적인 caspase-3의 기질 단백질에 해당되는 PARP의 발현 변화를 조사하였다. PARP는 정상세포의 DNA 수복이나 유전자 안정성 유지에 중요한 역할을 하며, apoptosis 유발 시 caspase-3에 의해 분해가 일어나면 이러한 회복기능이 상실된다[23].

제안 방법

150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.4), 20% glycerol (v/v), 1 mM EDTA, 0.2% NP-40 and 10 mM DL-DTT] 50 μl를 혼합하여 각 sample 당 총 양이 100 μl가 되게 하였다.
적정 시간 pachymic acid가 처리된 세포를 모은 후, 10 μM의 JC-1 용액을 이용하여 실온, 암하의 조건에서 염색을 시켰다. 30분 후, JC-1 용약을 제거하고 PBS로 수세한후 FACSCalibur를 이용하여 MMP의 양적 변화를 조사하였다.
Apoptosis 유발에 있어서 중요한 작용을 하는 것으로 알려진 caspase의 활성 정도가 pachymic acid 처리에 의하여 어떠한 변화를 유발하는지 알아보기 위하여 정상 및 pachymic acid가 처리된 배지에서 24시간 배양된 세포를 모은 뒤 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하고 정량 하였다. 150 μg의 단백질이 함유된 50 μl의 sample에 기질 100 μM이 함유된 reaction buffer [40 mM HEPES (pH 7.
Pachymic acid 처리에 따른 세포 증식 억제 정도를 측정하기 위하여 6- well plate에 T24 세포를 well당 3×105개를 분주하고 pachymic acid를 적정 농도로 처리하여 배양하였다.
Pachymic acid에 의하여 유발된 apoptosis의 정도를 정량적으로 분석하기 위하여 정상 및 pachymic acid가 24시간 동안 처리된 세포들을 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거한 후 PBS를 이용하여 2~3회 정도 세척하였다. 준비된 세포는 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다.
2A에 나타낸 바와 같이 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시한 결과, 정상 배지에서 자란 T24 세포에서는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색되었으나 pachymic acid가 처리된 세포의 경우는 처리 농도의 증가에 따라 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 관찰되었다. 다음으로 pachymic acid 처리에 따른 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 비교 분석하기 위하여 상기와 동일한 조건으로 배양된 T24 세포를 대상으로 flow cytometry를 이용하여 apoptosis가 유발되었을 것으로 예상되는 sub-G1기에 해당하는 세포를 측정한 결과 Fig. 2B에 나타낸 바와 같다. 결과에서 알 수 있듯이 정상 배지에서 자란 암세포에서의 자연적 apoptosis 유발 빈도는 약 3.
다음은 apoptosis 유도에 중심적인 역할을 하는 caspase 단백질들의 활성을 억제하는 IAP family에 속하는 cIAP-1, cIAP-2 및 XIAP의 발현 변화를 Western blotting을 통해 관찰하였으며, 조사된 3가지 IAP family 인자들의 발현이 pachymic acid 처리에 의하여 현저하게 감소되었다(Fig. 3B). 이상의 결과를 살펴볼 때 pachymic acid에 의해 유발되는 apoptosis 과정에는 Bcl-2 및 IAP family 인자들의 발현 변화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
5 mg/ml 농도가 되게 처리하여 2시간 동안 배양하고, 배지를 제거한 후 DMSO를 2 ml씩 분주하여 well에 생성된 formazan을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세포의 생존율을 측정하기 위하여 위와 같은 조건으로 세포를 배양한 후 배지를 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)를 각 well 당 1 ml을 첨가하여 세포를 부유시킨 다음 0.5% trypan blue solution (Gibco-BRL)을 동량으로 첨가하여 2분간 처리하였다. 처리된 sample을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 비교하였다.
준비된 세포는 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit를 이용하여 고정 및 염색을 하여 4℃, 암실에서 30분 동안 반응을 시켰다. 반응시킨 세포를 35-mm mesh를 이용하여 단일세포로 분리한 후 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 적용시켜 형광반응에 따른 Cellular DNA con-tent 및 histogram을 CellQuest software 및 ModiFit LT (Becton Dickinson) 프로그램을 이용하여 분석하였다.
분리된 단백질이 전이된 nitrocellulose membrane을 5% skim milk를 처리하여 비 특이적인 단백질들에 대한 blocking을 실시하고 1차 항체를 처리하여 상온에서 2시간 이상 또는 4℃에서 over night 시킨 다음 PBS-T로 세척(15분간 1번, 5분간 5번)하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체(PBS-T로 1:1,500으로 희석하여 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 정도 반응시켰다. 반응이 끝난 후 암실에서 enhanced chemiluminoesence (ECL) solution (Amersham Life Science Co.)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정단백질의 발현 양을 분석하였다.
5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM phenymethylsulfonyl fluoride (PMSF), 5 mM dithiothreitol (DTT)]를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 14,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액에 있는 total 단백질을 분리하였다. 상층액의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 정량 시약(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 그 사용방법에 따라 정량 한 다음 동량의 Laemmli sample buffer (Bio-Rad)를 섞어서 sample을 만들었다. 동량의 sample을 sodium dodecyl sulphate (SDS)-polyacrylamide gel을 이용하여 전기영동으로 분리한 후, nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA)으로 electroblotting에 의해 전이시켰다.
세포가 부착된 slide glass를 PBS로 2~3회 정도 세척하고 PBS가 마르기 전에 0.2%의 Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co.)을 첨가하여 상온에서 10분간 고정한 후 2.5 μg/ml 농도의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다.
1A 및 B에 나타난 바와 같이 pachymic acid는 처리 농도 의존적으로 T24 세포의 생존율의 감소 및 증식 억제 효과를 보여주었다. 아울러 pachymic acid 처리에 의해 유발되는 증식억제가 apoptosis 유발과 직접적인 연관이 있는지를 확인하기 위하여 정상 및 pachymic acid를 적정농도로 처리한 배지에서 24시간 동안 배양된 T24 세포에서 핵의 형태변화 및 sub-G1기 세포의 빈도를 조사하였다. 먼저 Fig.
여기에 caspase-3에 따른 기질 5 μl를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다.
5 μg/ml 농도의 DAPI 용액을 처리하여 상온에서 15분간 염색하였다. 염색이 끝난 후 DAPI 용액을 충분하게 세척하고 mounting solution을 처리한 후 형광 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 암세포 핵의 형태 변화를 관찰하였다.
이상의 결과에서 pachymic acid에 의한 apoptosis의 유발에는 mitochondria의 기능 손상이 연관되었을 것으로 추정되어 mitochondria 활성의 평가로 이용되는 MMP의 값을 JC-1염색으로 통하여 분석하였다. Fig.
인체방광암 T24 세포의 증식에 미치는 pachymic acid의 영향을 알아보기 위하여 pachymic acid를 적정농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 hemocytometer counting 및 MTT as-say를 실시하였다. Fig.
5% trypan blue solution (Gibco-BRL)을 동량으로 첨가하여 2분간 처리하였다. 처리된 sample을 hemocytometer에 적용한 후 도립 현미경(Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 살아있는 세포의 수를 비교하였다.

대상 데이터

MMP 값의 변화 여부를 조사하기 위하여 dual-emission potential-sensitive probe인 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethyl- imidacarbocyanine iodide (JC-1, Sigma-Aldrich Co.) 를 사용하였다.
에서 구입하였다. 단백질 분석을 위하여 사용된 actin, Bcl-2, Bcl-xL, Bax, Bad, Bid, XIAP, cIAP-1, cIAP-2, caspase-3, -8, -9 및 PARP 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, immunoblotting을 위해 2차 항체로 사용된 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse 및 anti-rabbit 항체는 Amersham Life Science Co. (Arlington Heights, IL, USA)에서 구입하였다. Caspase의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 pachymic acid는 Nagara Science Co., Ltd. (Gifu, Japan)에서 구입하였으며 dimethyl sulfoxide (DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 20 mM 농도로 녹여 사용하였다. 암세포의 증식억제 정도를 측정 하기 위한 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 세포 핵의 형태변화 관찰을 위한 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)은 Sigma-Aldrich Co.
Caspase의 in vitro 활성 측정을 위한 colorimetric assay kit는 R&D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. 세포주기 분석을 위하여 사용된 CycleTEST PLUS DNA REAGENT Kit 는 Becton Dickinson (San Jose, CA, USA)에서 구입하였다.
여기에 caspase-3에 따른 기질 5 μl를 첨가하여 37℃, 암실에서 3시간 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 405 nm의 흡광도를 이용하여 반응의 정도를 측정하였다. 실험에 사용된 기질은 caspase-3의 경우에는 Asp-Glu-Val-Asp (DEVD)-p-nitroaniline (pNA)이었고, caspase-8의 경우에는 Ile-Glu-Thr-Asp (IETD)-pNA이었으며, caspase-9은 Leu-Glu-His-Asp (LEHD)- pNA였다.
실험에 사용한 T24 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 분주 받아 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1%의 penicillin 및 streptomycin이 포함된 RPMI-1640 배지(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.

데이터처리

Significance was determined using a Student’s t-test (* p<0.05 vs. untreated control).
Significance was determined using a Student’s t-test (*, p<0.05 vs. untreated control).
The significance was determined by the Student’s t-test (*p<0.05 vs. untreated control).
모든 실험결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였고 SigmaPlot 을 이용하여 Student t-test를 이용하여 통계적 유의성을 얻었다.

이론/모형

다음은 apoptosis 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 유전자로 알려진 Bcl-2 family 인자들의 발현에 미치는 pachymic acid의 영향을 Western blotting을 이용하여 조사하였다. 그결과 Bcl-2 family에 속하는 인자들 중, pro-apoptotic 유전자인 Bax 및 Bad의 발현이 pachymic acid 처리 농도 의존적으로 현저하게 증가되었으며, anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현은 현저히 감소되었다.

성능/효과

이상의 결과에서 pachymic acid에 의한 apoptosis의 유발에는 mitochondria의 기능 손상이 연관되었을 것으로 추정되어 mitochondria 활성의 평가로 이용되는 MMP의 값을 JC-1염색으로 통하여 분석하였다. Fig. 4의 결과에서 알 수 있듯이, pachymic acid의 처리 농도가 증가될수록 mitochondria의 기능이 정상적으로 이루어지고 있음을 보여주는 적형광의 색을 띠는 세포의 수가 감소된 만큼, MMP의 소실을 의미하는 녹형광색을 띠는 세포의 수가 증가되었다. 이는 pachymic acid 처리에 따른 mitochondria 막의 교란 유도가 증가되었음을 보여준 결과이다.
PARP는 정상세포의 DNA 수복이나 유전자 안정성 유지에 중요한 역할을 하며, apoptosis 유발 시 caspase-3에 의해 분해가 일어나면 이러한 회복기능이 상실된다[23]. Fig. 5A에 나타낸 것처럼 pachymic acid 처리 농도의 증가에 따라 PARP 단백질의 단편 화가 증가하였으며, pachymic acid 처리에 따른 T24 세포의 apoptosis 유발은 caspase-3의 활성을 통한 표적단백질의 단편화에 의하여 이루어지고 있음을 알 수 있었다.
특히 이들 중 XIAP는 가장 강력한 IAP로서 대부분의 암세포에서 높은 수준으로 존재하고 있는 것으로 밝혀져 있다[2, 7]. Pachymic acid 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발에 IAP family가 관여하는지의 여부를 조사한 결과, pachymic acid 처리 농도 의존적으로 T24 세포에서 조사된 3가지의 IAP family 단백질 모두의 발현이 감소되었다(Fig. 3B).
결과에서 알 수 있듯이 정상 배지에서 자란 암세포에서의 자연적 apoptosis 유발 빈도는 약 3.7%로 매우 낮았으나 pachymic acid 처리 농도가 증가할수록 sub-G1기의 세포의 빈도가 증가하여 20 μM 처리군에서는 약 24.8%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다.
따라서 본 연구에서는 pachymic acid 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과 pachymic acid 처리 농도 의존적으로 Bax, Bad 및 tBid 단백질의 발현 증가와 더불어 Bcl-2 및 Bcl-xL 단백질의 발현 감소가 관찰되어(Fig. 3A), pachymic acid에 의한 T24 세포의 apoptosis 유발에 Bcl-2 family에 속하는 유전자의 발현의 변동이 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. 아울러 pachymic acid의 처리에 따른 MMP의 소실은 pachymic acid에 의한 mitochondria 막의 교란이 유발되었음을 의미하는 것으로(Fig.
다음은 apoptosis 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 유전자로 알려진 Bcl-2 family 인자들의 발현에 미치는 pachymic acid의 영향을 Western blotting을 이용하여 조사하였다. 그결과 Bcl-2 family에 속하는 인자들 중, pro-apoptotic 유전자인 Bax 및 Bad의 발현이 pachymic acid 처리 농도 의존적으로 현저하게 증가되었으며, anti-apoptotic 유전자인 Bcl-2와 Bcl-xL의 발현은 현저히 감소되었다. 또한 세포질에 있는 Bid의 경우 caspase-8의 활성화에 의해 truncation이 일어나 tBid 로 되면 mitochondria로 이동하여 intrinsic 경로를 증폭시키는 단백질로 알려져 있으며, pachymic acid 처리 시 Bid의 발현이 감소하고 tBid의 발현이 증가하였다(Fig.
5에서 나타난 바와 같이 pachymic acid 처리시 caspase-3, -8 및 -9의 활성형 단백질의 발현이 증가되고 불활성형 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 caspase의 활성 여부를 정량적으로 재확인 하기 위하여 in vitro caspase 활성을 분석한 결과, pachymic acid 처리에 따라 caspase-3, -8 및 -9의 활성 정도가 대조군과 비교하였을 때 처리 농도 의존적으로 유의적으로 증가되었음을 알 수 있었다(Fig. 6).
Caspase-3의 기질단백질 중 하나인 PARP 단백질은 eukaryotic nuclear enzyme family로서 DNA repair, 유전자 전사, 세포주기 진행, 염색체 기능, genomic stability 및 세포 죽음을 조절하며, caspase-3가 활성화되면 116 kDa의 분자량을 가진 PARP 단백질의 Asp214와 Gly215 사이에서 분해가 일어나서 85 및 24 kDa의 단편으로 proteolytic cleavage가 일어나서 apoptosis 촉진을 위한 효소적 활성을 획득하는 것으로 알려져 있다[23, 27]. 따라서 본 연구에서는 apoptosis에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 caspase-3, -8 및 -9의 발현에 pachymic acid가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사한 결과, caspase-3, -8 및 -9의 활성형 단백질 발현 및 정량적 활성 증가를 확인하였으며, caspase-3의 기질단백질인 PARP가 pachymic acid의 처리에 의하여 단편화가 유발되었음을 확인하였다 (Fig. 5 및 6).
아울러 pachymic acid 처리에 의해 유발되는 증식억제가 apoptosis 유발과 직접적인 연관이 있는지를 확인하기 위하여 정상 및 pachymic acid를 적정농도로 처리한 배지에서 24시간 동안 배양된 T24 세포에서 핵의 형태변화 및 sub-G1기 세포의 빈도를 조사하였다. 먼저 Fig. 2A에 나타낸 바와 같이 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DAPI 염색을 실시한 결과, 정상 배지에서 자란 T24 세포에서는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색되었으나 pachymic acid가 처리된 세포의 경우는 처리 농도의 증가에 따라 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축에 의한 apoptotic body가 관찰되었다. 다음으로 pachymic acid 처리에 따른 apoptosis 유발 정도를 정량적으로 비교 분석하기 위하여 상기와 동일한 조건으로 배양된 T24 세포를 대상으로 flow cytometry를 이용하여 apoptosis가 유발되었을 것으로 예상되는 sub-G1기에 해당하는 세포를 측정한 결과 Fig.
Extrinsic 및 intrinsic pathway의 활성화를 통한 apoptosis 유발에는 여러 종류의 caspase가 관여하는 것으로 알려져 있기에, pachymic acid 처리에 의한 apoptosis 유발에 있어서 이들의 활성이 관여하는 지의 여부를 조사하였다. 먼저 caspase의 발현 정도를 확인한 결과, Fig. 5에서 나타난 바와 같이 pachymic acid 처리시 caspase-3, -8 및 -9의 활성형 단백질의 발현이 증가되고 불활성형 단백질의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 caspase의 활성 여부를 정량적으로 재확인 하기 위하여 in vitro caspase 활성을 분석한 결과, pachymic acid 처리에 따라 caspase-3, -8 및 -9의 활성 정도가 대조군과 비교하였을 때 처리 농도 의존적으로 유의적으로 증가되었음을 알 수 있었다(Fig.
이는 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 pachymic acid의 처리에 의한 암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 시사하여 주는 것으로 사료된다. 아울러 flow cytometry 분석에 의한 apoptosis 유발 세포군에 해당하는 sub-G1기에 속하는 세포들의 빈도 역시 pachymic acid 처리 농도 의존적으로 증가되어 pachymic acid 처리에 따른 암세포의 증식 억제는 apoptosis 유발과 직접적인 연관이 있음을 알 수 있었다(Fig. 2B).
본 연구에서는 다양한 약리학적 활성을 가지는 것으로 알려진 pachymic acid의 항암효능을 알아보기 위하여 인체 방광암세포주인 T24 세포의 생존율 및 증식 억제에 미치는 영향과 이와 연관된 apoptosis 유발 여부 및 관련 인자들의 발현 변화를 조사하였다. 이를 위하여 먼저 pachymic acid의 처리에 따른 증식억제 정도를 조사한 결과, pachymic acid 처리 농도의존적으로 생존율 및 증식억제 현상이 나타났으며(Fig. 1), pachymic acid의 처리에 의한 암세포 생존율 및 증식의 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있을 것으로 기대되어 이에 대한 증거를 제시하기 위하여 암세포의 핵 형태 변화를 관찰한 결과, pachymic acid를 처리하지 않은 암세포에서는 핵의 형태가 뚜렷하게 정상으로 염색이 되었으나 pachymic acid가 처리된 암세포의 경우, pachymic acid 처리 농도 의존적으로 염색질 응축에 의한 apoptosis가 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 apoptotic body가 증가 되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2A). 이는 nucleosome의 linker DNA 부분의 절단에 의한 DNA 단편화의 결과이므로 pachymic acid의 처리에 의한 암세포의 증식억제 및 형태적 변형이 암세포의 apoptosis 유발과 밀접한 관련이 있음을 시사하여 주는 것으로 사료된다.
8%에 해당하는 세포가 sub-G1기로 관찰되었다. 이상의 결과는 pachymic acid 처리에 의한 증식억제가 apoptosis 유발과 밀접한 연관이 있음을 보는 주는 것이다.
3B). 이상의 결과를 살펴볼 때 pachymic acid에 의해 유발되는 apoptosis 과정에는 Bcl-2 및 IAP family 인자들의 발현 변화가 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과에서 pachymic acid는 extrinsic 및 intrinsic apoptosis pathway의 개시에 핵심적인 역할을 하는 caspase-8 및 -9의 활성을 모두 증가시켰으며, 이에 따른 caspase-3의 활성증가에 의하여 apoptosis가 유발되었음을 알 수 있었다. 이러한 두 경로의 동시 활성화에는 mitochondria의 기능 소실과 Bcl-2 및 IAP family의 발현 변화가 관여하고 있었으며, 특히 tBid의 발현 증가는 pachymic acid에 의한 intrinsic pathway를 증폭시키는 효과로 작용했을 것이라 추정된다.

후속연구

이러한 두 경로의 동시 활성화에는 mitochondria의 기능 소실과 Bcl-2 및 IAP family의 발현 변화가 관여하고 있었으며, 특히 tBid의 발현 증가는 pachymic acid에 의한 intrinsic pathway를 증폭시키는 효과로 작용했을 것이라 추정된다. 방광암의 치료에 보다 효과적인 생리활성을 갖는 물질을 발굴하고 그와 관련된 분자 및 세포수준에서의 기전을 밝히는 것이 중요하기에 본 연구의 결과는 향후 pachymic acid로 수행 될 추가 실험을 위한 기초자료로서 그 가치가 매우 높을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Pachymic acid는 무엇인가?	Pachymic acid는 복령에서 분리된 lanostane-type인 triterpenoid의 일종이다. 최근 pachymic acid가 항암 및 항염증 효능과 산화적 스트레스에 대한 항산화 효능 등과 같은 약리적인 효능이 있는 것으로 밝혀지고 있으나, 그에 대한 구체적인 분자생물학적 기전 연구는 매우 미비한 실정이다.
	pachymic acid는 어떤 효능이 있는가?	복령의 주요 생리활성 성분은 pachymic acid로 대표되는 lanostane type의 triterpene계 화합물이며, 그 동족체로서 tumulosic acid, eburicoic acid, dehydropachymic acid, poricoic acid 등이 보고되어 있다[25, 26]. 최근 연구에 의하면 pachymic acid은 항염증 및 항산화 효과[5, 28, 29] 뿐만 아니라, 암세포의 신생혈관 생성 억제, 세포주기 억제 및 apoptosis 유발등과 같은 항암활성을 가지는 것으로 보고 되어지고 있다[4, 8, 14]. 하지만 pachymic acid에 의해 유발하는 항암활성 작용 및 그에 따른 분자생물학적 기전에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다.
	caspase는 apoptosis에 관하여 어떤 기능을 하는가?	Cystein-containing aspartate-specific protease family인 caspase 또한 apoptosis에 의해 유발되는 많은 생화학적 또는 형태적 변화에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Caspase는 large subunit과 small subunit으로 구성되어 있으며 세포가 정상적으로 성장 및 생존할 때 핵과 mitochondria의 외막에 불활성 상태인 proenzyme 형태로 존재하지만 apoptosis를 유발하는 세포 내/외의 자극에 의하여 활성화되어 표적 단백질들의 분해를 유발한다. 이러한 caspase는 initiator caspase 및 effector caspase로 구분되어지며 특히 effector caspase인 caspase-3의 경우에는 extrinsic pathway에 의하여 활성화된 caspase-8 및 intrinsic pathway에 의하여 활성화된 caspase-9에 의하여 활성화되어 여러 종류의 기질 단백질들을 분해함으로써 apoptosis를 유발하는 중요한 효소로 알려져 있다.

참고문헌 (29)

Binder, M., Hibbett, D. S., Larsson, K. H., Larsson, E., Langer, E. and Langer, G. 2005. The phylogenetic distribution of resupinate forms across the major clades of mushroom-forming fungi (Homobasidiomycetes). Syst. Biodivers. 3, 113-157.

상세보기
Checinska, A., Hoogeland, B. S., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. and Kruyt, F. A. 2007. Role of XIAP in inhibiting cisplatin-induced caspase activation in non-small cell lung cancer cells: a small molecule Smac mimic sensitizes for chemotherapy-induced apoptosis by enhancing caspase-3 activation. Exp. Cell Res. 313, 1215-1224.

상세보기
Donovan, M. and Cotter, T. G. 2004. Control of mitochondrial integrity by Bcl-2 family members and caspase-independent cell death. Biochim. Biophys. Acta 1644, 133-147.

상세보기
Gapter, L., Wang, Z., Glinski, J. and Ng, K. Y. 2005. Induction of apoptosis in prostate cancer cells by pachymic acid from Poria cocos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 332, 1153-1161.

상세보기
Giner, E. M., Manez, S., Recio, M. C., Giner, R. M., Cerda-Nicolas, M. and Rios, J. L. 2000. In vivo studies on the anti-inflammatory activity of pachymic and dehydrotumulosic acids. Planta Med. 66, 221-227.

상세보기
Han, S. I., Kim, Y. S. and Kim, T. H. 2008. Role of apoptotic and necrotic cell death under physiologic conditions. BMB Rep. 41, 1-10.

원문보기 상세보기
Holcik, M., Gibson, H. and Korneluk, R. G. 2001. XIAP: apoptotic brake and promising therapeutic target. Apoptosis 6, 253-261.

상세보기
Kaminaga, T., Yasukawa, K., Kanno, H., Tai, T., Nunoura, Y. and Takido, M. 1996. Inhibitory effects of lanostane-type triterpene acids, the components of Poria cocos, on tumorpromotion by 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Oncology 53, 382-385.

상세보기
Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Ottaviano, Y., Davidson, N. E. and Poirier, G. G. 1993. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Res. 53, 3976-3985.

상세보기
Kirkali, Z., Chan, T., Manoharan, M., Algaba, F., Busch, C., Cheng, L., Kiemeney, L., Kriegmair, M., Montironi, R., Murphy, W. M., Sesterhenn, I. A., Tachibana, M. and Weider, J. 2005. Bladder cancer: epidemiology, staging and grading, and diagnosis. Urology 66, 4-34.

상세보기
Kroemer, G. 1997. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in regulating apoptosis. Nat. Med. 3, 614-620.

상세보기
Lazebnik, Y. A., Kaufmann, S. H., Desnoyers, S., Poirier, G. G. and Earnshaw, W. C. 1994. Cleavage of poly (ADP-ribose) polymerase by a proteinase with properties like ICE. Nature 371, 346-347.

상세보기
Lee, K. Y. and Jeon, Y. J. 2003. Polysaccharide isolated from Poria cocos sclerotiuminduces NF-κB/Rel activation and iNOS expression in murine macrophages. Int. Immunopharmacol. 3, 1353-1362.

상세보기
Li, G., Xu, M. L., Lee, C. S., Woo, M. H., Chang, H. W. and Son, J. K. 2004. Cytotoxicity and DNA topoisomerases inhibitory activity of constituents from the sclerotium of Poria cocos. Arch. Pharm. Res. 27, 829-833.

원문보기 상세보기
Li, H., Zhu, H., Xu, C. J. and Yuan, J. 1998. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis. Cell 94, 491-501.

상세보기
Li, P., Nijhawan, D., Budihardjo, I., Srinivasula, S. M., Ahmad, M., Alnemri, E. S. and Wang, X. 1997. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91, 479-489.

상세보기
Lindner, D. L. and Banik, M. T. 2008. Molecular phylogeny of Laetiporus and other brown rot polypore genera in North America. Mycologia 100, 417-430.

상세보기
Luo, X., Budihardjo, I., Zou, H., Slaughter, C. and Wang, X. 1998. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 94, 481-490.

상세보기
Nargund, V. H., Tanabalan, C. K. and Kabir, M. N. 2012. Management of non-muscle-invasive (superficial) bladder cancer. Semin. Oncol. 39, 559-572.

상세보기
Reed, J. C. 1998. Bcl-2 family proteins. Oncogene 17, 3225-3236.

상세보기
Rosse, T., Olivier, R., Monney, L., Rager, M., Conus, S., Fellay, I., Jansen, B. and Borner, C. 1998. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome c. Nature 391, 496-499.

상세보기
Salvesen, G. S. and Duckett, C. S. 2002. IAP proteins: blocking the road to death’s door. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 401-410.

상세보기
Schreiber, V., Dantzer, F., Ame, J. C. and de Murcia, G. 2006. Poly (ADP-ribose): novel functions for an old molecule. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 517-528.

상세보기
Smaldone, M. C., Jacobs, B. L., Smaldone, A. M. and Hrebinko, R. L. Jr. 2008. Long-term results of selective partial cystectomy for invasive urothelial bladder carcinoma. Urology 72, 613-616.

상세보기
Tai, T., Shingu, T., Kikuchi, T., Tezuka, Y. and Akahori, A. 1995. Isolation of lanostane-type triterpene acids having an acetoxyl group from sclerotia of Poria cocos. Phytochemistry 40, 225-231.

상세보기
Tai, T., Shingu, T., Kikuchi, T., Tezuka, Y. and Akahori, A. 1995. Triterpenes from the surface layer of Poria cocos. Phytochemistry 39, 1165-1169.

상세보기
Tewari, M., Quan, L. T., O’Rourke, K., Desnoyers, S., Zeng, Z., Beidler, D. R, Poirier, G. G., Salvesen, G. S. and Dixit, V. M. 1995. Yama/ CPP32 beta, a mammalian homolog of CED-3, is a CrmA-inhibitable protease that cleaves the death substrate poly (ADP-ribose) polymerase. Cell 81, 801-809.

상세보기
Yasukawa, K., Kaminaga, T., Kitanaka, S., Tai, T., Nunoura, Y., Natori, S. and Takido, M. 1998. 3β-p-Hydrooxybenzoyldehydrotumulosic acid from Poria cocos, and anti-inflammatory effect. Phytochemistry 48, 1357-1360.

상세보기
Zhou, L., Zhang, Y., Gapter, L. A., Ling, H., Agarwal, R. and Ng, K. Y. 2008. Cytotoxic and anti-oxidant activities of lanostane-type triterpenes isolated from Poria cocos. Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 56, 1459-1462.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증