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문제 정의
- 따라서 본 연구는 OPU 유래 수정란 생산 system을 이용하여 개량가축의 대량생산에 필요한 수정란의 대량생산을 위한Elite cow의 반복 활용을 위해 첫 번째 채란기간의 난포란 채란에 의한 외래상처가 적절한 휴식으로 생식기능의 회복 가능한 시간과 보다 효율적인 수정란 생산을 위한 두 번째 채란기간과 수정란 생산으로 공란우의 반복사용 가능성 및 OPU-IVP 체계가 가축개량에 필요한 수정란의 대량생산으로 산업화 활용 가능성을 조사하였다.
가설 설정
- 또한 본 연구의 공란우 6두를 이용하여 첫 번째 기간의 OPU 유래 생산된 수정란은각각 3∼6개월 동안 두당 평균 160개의 수정란을 생산한 것은 Elite cow의 공란우 1두에서 수태율 50%를 가정하여 80두이상의 자손을 대량생산이 가능한 것을 의미한다.
제안 방법
- 난포 관찰은 난소를 견인하여 질 내에 고정된 탐촉자 선단부에 밀착하여 Monitor에 전달되는 난포를 확인하였고, 채란가능한 난포는 Monitor의 Biopsy Line에 횡/절단시켜 난포의 외각선이 뚜렷하게 관찰되도록 조정 및 고정하였다. Monitor Image에 고정된 2 mm 이상의 난포를 일회용 주사침(18 G)을이용하여 난포란 흡입으로 난포의 수량을 확인하였다. 이때 사용된 진공 음압은 50∼70 mm Hg(10∼15 ml/min)의 압력으로 채란 완료까지 진행 및 유지하였다.
- OPU of A, B and C group was carried out on times of before break, to rest time of less than six months and over 6 months.
- OPU 유래 체외수정란 생산용 정액 선정은 본 연구에 선발된 한우 공란우를 사단법인 한국종축개량협회 및 농촌진흥청국립축산과학원 등에서 제공된 근친도 확인 및 계획교배 프로그램을 이용하여 근친 여부와 후대의 예상능력치 등을 확인 및분석으로 개량의 효율을 극대화를 위해 각각의 공란우와 적합한 국내에서 생산되고 있는 KPN(Korean Proven Bull No) 정액을 선정하였고, 체외수정은 공란우에 따라 개체별 실시하였다. 체외수정 배양액에 6 mg/ml의 BSA를 첨가하고, 100 IU/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin 항생제가 첨가된 배양액을 배양기에서 4∼5시간 전 배양을 실시하여 평형을 유도하였다.
- Pellet 형태의 정자는 20 μg/ml Heparin이 첨가된 배양액으로 배양기에서 15분간 수정능획득을 유도하였고, 수정능력 획득된 정자는 1∼2 × 106 sperms/ml가 되도록 최종농도를 조정한 후 98∼99% 습도, 38℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 체외수정을 유도하였다.
- 각 공란우에서 회수된 난자의 성숙과 수정 후 체외배양은 CR1aa 배양액(Rosenkrans 등, 1993)에 3 mg/ml BSA와 10% FBS를 첨가하여 이용하였다. 체외수정 18∼22시간 후에 3 mg/ ml BSA 첨가된 CR1aa 배양액으로 2∼3회 세척한 후 3일간 체외배양을 실시하고, 분할된 수정란을 선발하여 10% FBS가 첨가된 CR1aa 배양액으로 3일간 2차 체외배양으로 배반포를 생산하였다.
- 각 공란우에서 회수된난자는 98∼99% 습도, 38℃, 5% CO2 배양기에서 24시간동안배양으로 성숙을 유도하였고, 난구세포의 팽창과 세포질의 충실도 등으로 체외성숙을 판정하여 체외수정에 공시하였다.
- 난포 관찰은 난소를 견인하여 질 내에 고정된 탐촉자 선단부에 밀착하여 Monitor에 전달되는 난포를 확인하였고, 채란가능한 난포는 Monitor의 Biopsy Line에 횡/절단시켜 난포의 외각선이 뚜렷하게 관찰되도록 조정 및 고정하였다. Monitor Image에 고정된 2 mm 이상의 난포를 일회용 주사침(18 G)을이용하여 난포란 흡입으로 난포의 수량을 확인하였다.
- 또한 가축의 이동에 관련한 법적인 질병감염(구제역 황체 형성, 브루셀라, 요네병, 결핵) 여부 등의 검사를 실시하여 4∼ 10세 연령의 공란우를 선발하였다. 두 번째 기간의 수정란 생산용 공란우는 짧은 기간의 공태상태(휴식기간)에서 휴식, 첫번째 기간의 수정란 생산 후 인공수정으로 자우생산, 인공수정에 의한 초기 임신상태에서 약 4개월 동안 채란 후 임신 후반의 휴식 및 분만에 의한 각각의 휴식 등으로 첫 번째 채란기간 수정란 생산에 이용된 공란우의 반복사용을 위해 초기공란우 선발의 조건과 동일하게 전염성 질병 감염 여부를 확인하여 공란우로 다시 사용하였다.
- 또한 공란우는 개조된 보정틀을 이용하여 움직임을 최소화하였고, 복부 및 질벽의 긴장 완화를 위해 7 mg Xylazine HCl(Rompun, ㈜바이엘)과 2% Lidocaine (㈜대한)을 두당 0.3 ml와 3∼4 ml를 각각 미 정맥 및 미추 1번과 2번 사이에 투여하였다(이 등, 1998).
- 유전적 가치가 우수한 공란우의 수정란 및 자우를 보다 많이 생산하기 위한 공란우 반복사용 가능성 조사를 위해 첫 번째 채란기간의 수정란을 생산한 다음, 인공수정으로 두 번의 송아지를 생산한 공란우, 임신초기 약 3개월 동안 채란 후 분만을 위한 생식기능의 휴식 및 채란 후 공태상태에서 일정한 휴식으로 두 번째 채란을 위해 각 공란우에서 첫 번째 기간의 채란과 동일방법으로 매주 2회 총 15∼65회 반복사용에 활용한 결과는 Table 2와 같다.
- 이러한 과정을 공란우마다 3∼4일 간격으로 매주 2회 반복 및 연속적으로 실시하였다.
- 체외수정 18∼22시간 후에 3 mg/ ml BSA 첨가된 CR1aa 배양액으로 2∼3회 세척한 후 3일간 체외배양을 실시하고, 분할된 수정란을 선발하여 10% FBS가 첨가된 CR1aa 배양액으로 3일간 2차 체외배양으로 배반포를 생산하였다.
- 체외수정 배양액에 6 mg/ml의 BSA를 첨가하고, 100 IU/ml의 penicillin, 100 μg/ml의 streptomycin 항생제가 첨가된 배양액을 배양기에서 4∼5시간 전 배양을 실시하여 평형을 유도하였다.
- 최종 선발된 공란우에서 첫 번째 수정란 기간의 채란은 각각 11∼24주(22회∼48회)까지 실시하였고, 두 번째 OPU-IVP채란을 위해 2∼6개월 동안 공태상태, 채란 후 인공수정으로 임신에 의한 분만 또는 임신초기 채란과 분만 등 각각의 적절한 휴식으로 두 번째 기간의 채란은 각각의 공란우에서 2∼7개월 동안 전과 동일하게 3∼4일 간격으로 매주 2회씩 OPU 방식으로 수정란 생산을 위해 채란을 실시하였다(진 등, 2011; 최 등, 2011).
- 한우 공란우의 선발은 각 지역의 축산업협동조합 및 사단법인 한국종축개량협회(www.aiak.or.kr)의 자료를 기초로 외조부, 외조모가 등록된 3계대 이상의 혈통 및 고등등록, 후대에게 물려줄 수 있는 예상유전 전달능력(EPD; Expected Progeny Difference), 후대 및 형매의 도축 출하된 성적 등의 자료를 비교분석하여 체형에 관련된 외모심사 및 초음파 진단기에 의한육질검사 등을 통하여 개체의 경제형질이 우수하다고 판정된 개체를 직장검사를 통해 생식기관의 상태와 비만도(BSC; body score condition)를 점검하였다.
- 흡입된 난포란은 2∼3회 washing으로 혈액 등의 이물질을 제거하여 실체현미경 하에서 회수하였고, 난자의 등급분류는 세포질의 분포도와 난구세포 부착 정도에 따라 평가기준을 Grade Ⅰ∼Ⅳ까지 설정하여 분류하였다(Merton 등, 2003; Petyim 등, 2003). 회수된 모든 난자를 각 공란우별 각각의 체외성숙용 배지에 제공하였다.
- 흡입된 난포란은 2∼3회 washing으로 혈액 등의 이물질을 제거하여 실체현미경 하에서 회수하였고, 난자의 등급분류는 세포질의 분포도와 난구세포 부착 정도에 따라 평가기준을 Grade Ⅰ∼Ⅳ까지 설정하여 분류하였다(Merton 등, 2003; Petyim 등, 2003).
대상 데이터
- 또한 가축의 이동에 관련한 법적인 질병감염(구제역 황체 형성, 브루셀라, 요네병, 결핵) 여부 등의 검사를 실시하여 4∼ 10세 연령의 공란우를 선발하였다.
데이터처리
- 각 공란우에서 채란 당 관찰 및 흡입된 난포의 수, 회수된 난자의 수, 첫 번째 및 휴식기간에 따른 두 번째 기간의 수정란 평균 생산량 등은 ANOVA를 이용하여 유의성을 분석하였다(p<0.05).
- 본 실험에서 얻어진 결과들의 값은 Mean±SE으로 표시하였고, 개체별, 그룹 간의 통계학적 분석은 SPSS 19.0 for Window package(Statistical Package for Social Science, SPSS Ince, Chi- cago, IL, USA)를 이용하였으며, 유의적 수준은 5%에서 검증하였다.
이론/모형
- 생체 내 난포란의 관찰은 MyLabTM30VETGOLD(Esaote, Ge- nova, ITALY) 및 탐촉자(EC123; Micro-Convex 9∼3 MHz, Esaote, Genova, ITALY)는 6.6 MHz convex scanner를 사용하였고, 미성숙 난자 흡인에 일회용 주사침(18 G)을 사용하였다(Bungartz 등, 1995; Bols 등, 1996).
- 체외성숙은 Deb 등(2011)의 방법으로 성숙배양액(TCM-199)에 10%(vol/vol)의 fetal bovine serum(FBS, Gibco), 10 mg/ml의 FSH(follicle stimulation hormone, Sigma), 1 mg/ml의 Estradiol (Sigma)과 항생제(100 IU/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin)를 첨가된 체외성숙용 배양액은 배양기에서 4∼5시간 이상 전 배양을 실시하여 평형을 유도하였다.
성능/효과
- 9%가 형성되었다. A는 첫 번째 26회 채란 후 10개월의 휴식과 29회 채란으로 총 55회, B는 25회 채란 후 2개월의 휴식과 22회 총 47회, C는 22회 채란 후 7개월의 휴식과 65회 총 87회, D는 48회 채란 후 분만 등으로 25개월의 휴식과 15회 총 63회, E는 25회 채란 후 3개월의 휴식과 31회 총 56회, F는 40회 채란 후 6개월의 휴식과 50회 총 90회 채란으로 회수되는 난자, 등급 및 수정란의 평균수가 다르게 나타나는 것은 개체간의 차이, 사육되는 환경, 총 채란횟수, 첫 번째 기간의 채란횟수가 두 번째 기간의 채란에 미치는 영향, 휴식 기간 등이 난포의 성장, 난자가 회수되는 수량과 수정란으로 생산되는 평균수량에 영향 미치는 것으로 사료된다.
- 각 지역에서 공란우의 선발조건에 따라 냉도체중, 배최장근단면적, 등지방 두께 및 육질 등의 형질 개량용으로 선발된 한우 A, B, C, D, E 및 F에서 26, 25, 22, 48, 25 및 40회 난포란채란으로 회수된 난자는 총 188에서 816개를 각각 48.6∼64.7%의 회수율을 보였으며, 각 공란우에서 횟수 당 평균 11.2±0.6, 10.1±0.5, 8.5±0.9, 17.0±0.9, 10.2±0.7 및 9.6±0.6개의 난자를 회수하여 각 개체 간 회수된 난자의 평균은 D 공란우(17.0±0.9)가 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 각각의 휴식으로 회수된 난자가 10개월 휴식의 A개체는 29회 채란으로 평균 10.9±0.8개, 2개월 휴식의 B개체는 평균 5.2±0.4개, 임신초기 약 3개월 채란 후분만을 위한 7개월 휴식의 C개체는 8.9±0.5개, 첫 번째 기간의 채란 후 인공수정으로 2번의 분만으로 25개월 휴식의 D개체는 평균 12.6±1.3개, 3개월 휴식의 E개체는 평균 6.6±0.5개, 6개월 휴식의 F개체는 평균 9.9±0.5개를 회수하여 첫 번째 수정란의 생산기간보다 A, C 및 F개체를 제외한 모든 개체에서회수된 난자의 평균수는 감소하였다.
- 그러나 각각의 공란우에서 회수된 난자의 평균수량이 D 개체를 제외한 그 외공란우는 비슷하였으나, 수정란의 평균 생산량과 생산비율(각각 28.8∼64.4%)은 각각 다르게 나타났다.
- 그러나 수정란 생산을 위한 각각의 단계에서 휴식 전 A군, 6개월 이하 휴식의 B군 및 6개월 이상 휴식 C군의 난자 회수율은 56.4%, 51.0% 및 49.3%, 배반포까지 형성은 44.0%, 33.3 % 및 42.1%로 각각의 단계별로 비슷한 비율을 보였다. 또한 Fig.
- 05). 그러나 첫 번째와 두 번째 수정란 생산기간의 난자 회수율(56.4%와51.0%), 분할율(80.4%와 79.4%) 및 배반포까지 형성되는 비율(43.9%와 37.3%)은 각 단계에서 유사하였고, 또한 두 번째 기간의 OPU-IVP에 의해 전체 평균 3.3개의 수정란이 생산되어 공란우 반복사용 가능성을 확인할 수 있었다.
- 그러나 회수된 난자의 비율은 첫 번째와 두 번째의 채란기간에서 개체에 따라 48.6∼64.7%와 44.1∼55.7%, 수정란 생산 비율에서도 28.8~64.4%와 28.1∼48.0%로 동일한 조건의 수정란 생산방법에서 각 개체에 따라 다르게 나타났다.
- 따라서 본 연구에서 한우는 냉도체중, 배최장근 단면적, 등지방 두께와 근내지방도 등, 젖소는 유량, 유지방, 유단백질, 강건성 등 개량에 필요한 경제형질이 우수한 유전자를 보유한 Elite 개체에서 첫 번째 기간 OPU-IVP에 이용한 공란우를 보다 많은 수정란의 추가생산을 위해 공란우 반복 재사용을 위한 적절한 휴식시간을 조사한 결과, 휴식 전의 공란우 6두에서 평균 5.2개, 6개월 이하의 휴식군은 평균 2.6개 및 6개월 이상의 휴식으로 평균 3.9개를 생산하여 첫 번째 기간에 수정란을 생산 후 공태 상태 또는 분만 등으로 최소 6개월 이상의 휴식이 필요한 것으로 판단된다. 또한 공란우 6두에서 총 427회 채란으로 4,267개의 난자를 회수하여 총 1,766개의 배반포가 형성되어 두당 평균 294.
- 따라서 유전적 가치가 우수한 Elite cow에서 보다 많은 수정란 생산을 위하여 첫 번째 채란기간 후 적절한 휴식(6개월 이상)과 두 번째 기간의 채란으로 공란우의 반복사용이 가능하고, 그것으로 인하여 개량 자우의 대량생산을 위한 개뱔압버으로 OPU 유래 수정란 생산 및 이식체계가 효율적인 것으로 판단된다.
- 9개를 생산하여 첫 번째 기간에 수정란을 생산 후 공태 상태 또는 분만 등으로 최소 6개월 이상의 휴식이 필요한 것으로 판단된다. 또한 공란우 6두에서 총 427회 채란으로 4,267개의 난자를 회수하여 총 1,766개의 배반포가 형성되어 두당 평균 294.3개의 수정란을 생산한 결과는 OPU 유래 수정란 생산방식으로 두당 이식가능한 수정란의 대량생산이 가능하고, 보다 많은 수정란생산을 위해 첫 번째 수정란 생산 후 기능의 회복을 위한 적절한 휴식시간이 필요하며, 그것으로 인하여 공란우의 반복사용이 가능한 것으로 조사되었다.
- 또한 배반포로 형성된 수정란은 각 공란우에 따라 총 92∼341개를 생산하여 횟수 당 평균은 A, C 및 F(3.5±0.5, 4.2 ±0.5 및 2.8±0.4개)보다 B, D 및 E(6.5±0.6, 7.1±0.6 및 6.5±0.5개)의 공란우가 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 또한 첫 번째와 두 번째 채란기간 사이의 OPU 유래 수정란 생산에서 휴식기간이 짧을수록(A개체; 2개월, E개체; 3개월, F개체; 6개월 미만) 회수되는 난자와 배반포까지 발달되는 평균수에서 유의적인 차이를 보였다(p<0.05).
- 또한 휴식에 의한 공란우의 반복사용에서 회수된 난자의 평균수는 휴식시간이 짧은 개체(B와 E)보다 휴식시간이 긴 개체(A와 D)가 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 보다 많은 수정란 생산을 위한 각각의 휴식기간으로 두 번째 수정란 생산기간에서 배반포까지 발달된 수정란의 평균수는 3.1±0.4개, 1.7±0.4개, 4.3 ±0.4개, 4.7±1.0개, 2.9±0.4개 및 2.9±0.4개로 짧은 휴식의 개체(B, E 및 F)가 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- 05). 이러한 결과는보다 많은 수정란의 추가생산을 위한 공란우의 반복사용 위해서는 첫 번째의 수정란을 생산한 다음 생식기능이 회복할 수있는 적절한 휴식기간이 필요한 것으로 판단되었다.
- 즉, 휴식 전과 후에서 총 186회와 212회 채란으로 평균 20.9±0.4개와 17.6±0.3개의 난포란를 흡입하여 회수된 난자는 평균 11.8±0.4개와 9.0±0.3개, 수정란으로 분할되는 평균수는 9.5±0.3개와 7.1±0.3개, 배반포 형성은 5.2±0.3개와 3.3±0.2개로 난포란 흡입에서 수정란의 생산까지 각각의 단계에서 휴식 전(첫 번째 OPU-IVP)이 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 회수된 G1+G2 등급의 난자는 A와 D(7.9±0.6와 8.5±0.7)의 공란우가 B, E보다, C, F(5.0±0.5, 6.0±0.5 vs. 2.7±0.3, 1.6±0.3)의 공란우보다 유의적으로 높았다(p<0.05).
- 휴식 전(A군), 6개월 이하의 휴식(B군) 및 6개월 이상의 휴식(C군)의 개체군에서 186회, 103회 및 138회 채란으로 횟수 당회수된 난자의 평균은 11.8±0.4개, 7.9±0.3개 및 9.2±0.4개, G1 +G2 등급은 5.4±0.3개, 1.9±0.2개 및 3.2±0.2개, 배반포까지 발달된 수는 5.2±0.3개, 2.6±0.2개 및 3.9±0.3개로 A군이 B, C 군보다 유의적으로 높았고(p<0.05), C군은 B군보다 유의적으로 높았다(p<0.05).
후속연구
- 0%가 조기에 도태되는 실정이다. 이러한 경제적 및 유전적 가치가 우수한 암소를 종빈우로 대량개량에 활용한다면 그 효과는 극대화 될 것이다.
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