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문제 정의
- 본 연구는 경제적 가치가 높은 육질등급, 즉 체지방의 정도에 따라 도축 암소 유래의 난자를 개체별로 채취하여 개체별 수정 및 배양 후 수정란 이식을 수행하여 이러한 개체별 한우 수정란 이식 기술이 농가 현장에 적용 가능한지 확인하고, 나아가서 체지방의 함량에 따른 체외 수정란의 발달율과 품질 및 임신율 등의 상관관계를 검토하였다.
- 이러한 체계의 확립은 한우의 도축 후 기록되어지는 개체의 육량 및 육질 등의 경제성을 고려하여 유전적으로 우수한 형질을 가진 한우 개체의 체외 수정란을 농가에 보급할 수 있기 때문에, 한우 개량의 방향성 결정에 매우 유용하게 이용되어질 것이다. 본 연구는 현 시점에서 한우의 경제적 개량 방향인 육질 개량 측면에서 도축 후 육질 등급별로 구분된 한우 개체별 난포란 유래 난자의 체외 발생능력을 검토하였다.
- 본 연구는 한우의 품질 개량에 있어서 수정란 이식기술을 이용하여 도축 후 개체별 한우 난소 유래 난포란으로부터 배반포의 체외 생산기법의 접목을 통해 실용적인 한우개량 체계를 정립하기 위해 수행되어졌으며, 한우의 육질개량 측면에서 도축 후 육질등급별로 구분된 한우 개체별 난포란 유래 난자의 체외 발생능력을 검토하였다. 도축 후 한우의 육질등급(1⁺⁺, 1⁺, 1, 2, 3)별 회수한 난포란 수는 난소 1개당 각각 평균 9.
제안 방법
- 모든 배양액은 사용하기 2주 전에 제조하여 0.22 μm membrane filter(Gelman Science, An Arbor, MI)로 여과하고, 4℃ 냉장고에 보관한 후 사용하기 전에 반드시 39℃, 5% CO2 배양기에서 4∼5시간 이상 평형한 후 사용하였다.
- 개체별로 회수한 난포란은 체외성숙용 배양액으로 1∼2회 세척한 후, mineral oil(Sigma, M-8410)로 피복된 50 μl의 체외성숙용 배양액에 각각 10∼20개씩 넣어 39℃, 5% CO2 배양기에서 2∼24시간 동안 각각 배양함으로서 체외성숙을 유도하였으며, 배양 후 난구세포가 잘 확산된 난포란을 선발하여 체외수정에 사용하였다.
- 회수한 난포란을 TL-HEPES 용액으로 2∼3회 세척한 후 상층액을 제거하고, 실체현미경(×100∼×200)하에서 모든 난포란을 회수하여 개체별로 35 mm petri dish(Falcon, 3001)에 분주하였다.
- 도축장에서 개체별로 운반된 난소는 생리 식염수로 2∼3회 세척하여 난소 표면의 혈액과 이물질을 제거한 후, 1회용 10ml 주사기에 18 gauge 주사침을 부착하여 2∼8 mm 직경의 가시난포로부터 난포란을 개체별로 회수하였다.
- 2에서 보는 바와 같다. 익일 축산물등급판정소의 소 도체등급 판정기록표에 의거 채취한 난소의 도축번호와 대조하여 도체의 육질등급과 육량등급을 기록하였고, 한국종축개량협회의 한우개체정보 조회를 이용한 바코드로 개체별로 추적하여 혈통과 생년월일을 조사하였다.
- 수정란 이식을 위한 수란우는 경상남도 의령군 소재 합천목장에서 생후 16개월 이상된 건강한 미경산우의 F1(한우×젖소)이었으며, 수정란 이식 시술을 하기 전 3회 이상의 정상적인 발정주기를 보인 미경산우만 선발하여, 발정 7일째에 직장검사를 실시하여 자궁과 난소의 상태 및 황체의 위치(좌 또는 우)를 확인하고, 황체의 크기(직경 15∼25 mm)와 형태가 정상인 수란우를 발정주기에 관계없이 25 ml의 prostaglandin F2α 를 1일 간격으로 2회 근육 주사하여 발정동기화를 유도하였다.
- 배양 48시간째에 10% FBS가 첨가된 CR1a 배양액으로 교체하였으며, 그 후 48시간마다 신선 배양액으로 교체하면서 7∼8일째까지 계속 배양하여 배반포로의 배발달을 확인하였다.
- 회수된 개체별 체외수정란을 미리 준비해둔 0.3% BSA가 첨가된 CR1a 용액으로 2∼3회 washing 한 후, 60 mm petri dish에 30 μl drop의 배양액에 넣어 39℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 24시간동안 체외수정을 실시한 후, 개체별 난포란은 200 μl의 micropipete(Gilson, Pipetman P200)을 이용한 pipeting으로 난구세포 층을 제거하고, 실체 현미경하에서 난자 내 제 2극체 유무와 관계없이 형태적으로 정상이라고 판단되는 난자를 회수하였다.
- 체외수정은 체외성숙한 난포란을 1∼2회 세척한 후, 미리 준비해둔 60 mm petri dish(Falcon, 3002)에 mineral oil로 피복된 50 μl drop의 Fer-TALP 배양액에 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기에서 정자와 난자를 24시간 동안 공배양하여 체외수정을 유도하였다.
- 체외수정용 정자는 농협중앙회 가축개량사업소에서 선정한 종모우 동결정액(—196℃)을 사용하였다. 동결정액은 상온에서 10초간 방치한 후 39℃의 물에서 20초간 침적하였고, 소독한 가위로 straw 양끝을 자르고, 미리 준비해둔 각 2 ml의 Sp-TALP 배양액에 45%와 90% Percoll(Sigma, P-4937)로 층이 만들어진 15 ml 원심분리관(Falcon, 2097)에 조심스럽게 정액을 넣고, 2,000 rpm으로 20분간 원심분리를 한 후 하층부의 정자괴만을 회수하였다. 회수한 정자괴를 Sp-TALP 배양액에서 700rpm으로 5분간, 2회 원심분리한 후 최종 정자농도가 1×106 마리/ml가 되도록 조절하여 체외수정용 정자로서 준비하였다.
- 회수한 정자괴를 Sp-TALP 배양액에서 700rpm으로 5분간, 2회 원심분리한 후 최종 정자농도가 1×106 마리/ml가 되도록 조절하여 체외수정용 정자로서 준비하였다. 체외수정을 위해 형태적으로 난구세포가 확장된 난포란만을 선별하여 0.03% hyaluronidase(Sigma, H-3507) 첨가 Fer-TALP 용액으로 처리하여 난구세포를 제거하고, 체외수정에 제공하였다. 체외수정은 체외성숙한 난포란을 1∼2회 세척한 후, 미리 준비해둔 60 mm petri dish(Falcon, 3002)에 mineral oil로 피복된 50 μl drop의 Fer-TALP 배양액에 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기에서 정자와 난자를 24시간 동안 공배양하여 체외수정을 유도하였다.
- 체외생산된 배반포의 품질평가는 8일령 배반포의 전체 세포 수와 세포자연사 유래 사멸 세포 수를 형광 현미경하에서 측정하였다. 배반포는 0.
- 이렇게 처리된 배반포는 TUNEL 분석 시약(TUNEL, terminal deoxy nucleotidyl transferase dUTP nick end labeling, In Situ Cel Death Detection Kit; Roche, Penzberg, Germany)으로 37℃, 어두운 곳에서 1시간 동안 처리하였다. TUNEL 시약 처리 후 모든 배반포는 Hoechst 33342(10 mg/ml in PBS; Sigma-Aldrich; stains all nuclei, shows nuclear morphology) 시약으로 상온에서 5분간 대비염색하여 형광현미경(BX50; Olympus)으로 관찰하였다.
- 수정란 이식을 위한 수란우는 경상남도 의령군 소재 합천목장에서 생후 16개월 이상된 건강한 미경산우의 F1(한우×젖소)이었으며, 수정란 이식 시술을 하기 전 3회 이상의 정상적인 발정주기를 보인 미경산우만 선발하여, 발정 7일째에 직장검사를 실시하여 자궁과 난소의 상태 및 황체의 위치(좌 또는 우)를 확인하고, 황체의 크기(직경 15∼25 mm)와 형태가 정상인 수란우를 발정주기에 관계없이 25 ml의 prostaglandin F2α 를 1일 간격으로 2회 근육 주사하여 발정동기화를 유도하였다. 발정동기화를 유도한 수란우는 1일 3회, 1회 30분 이상 관찰하여 standing estrus(발정 0일)를 보이는 개체를 수란우로 판정하여 발정 7일째에 비 외과적 자궁경관 경유법에 의해 수정란을 이식하였다. 수란우의 수태율을 조사하기 위해 배반포를 이식한 후 50일째에 직장검사법으로 태막 및 양막낭을 촉진하였다.
- 발정동기화를 유도한 수란우는 1일 3회, 1회 30분 이상 관찰하여 standing estrus(발정 0일)를 보이는 개체를 수란우로 판정하여 발정 7일째에 비 외과적 자궁경관 경유법에 의해 수정란을 이식하였다. 수란우의 수태율을 조사하기 위해 배반포를 이식한 후 50일째에 직장검사법으로 태막 및 양막낭을 촉진하였다.
- 미성숙 난포란의 회수 및 세척용 배양액은 10 mM HEPES(Sigma, H-6147)와 3.0 mg/ml bovine serum albumin(BSA, Sigma, A-9647)이 첨가된 HEPES buffered Tyrode’s medium (TLHEPES)이고, 미성숙 난자의 체외성숙용 배양액은 10% heatinactivated fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL, 26140-070)이 첨가된 TCM-199(Gibco BRL, 12340-030) 배양액에 1 μg/ml folicle stimulating hormone(FSH: Sigma, F-4021), 1 μg/ml estradiol-17β(Sigma, E-6253)을 첨가하여 사용하였다.
- 초기배(2∼8세포기) 난자의 배양을 위한 배양액은 0.3% bovine serum albumin (BSA: Sigma, A-6003)이 첨가된 CR1a, 후기 배(8세포기∼배반포) 배양을 위해서는 10% FBS가 첨가된 CR1a를 사용하였다.
대상 데이터
- 0 mg/ml bovine serum albumin(BSA, Sigma, A-9647)이 첨가된 HEPES buffered Tyrode’s medium (TLHEPES)이고, 미성숙 난자의 체외성숙용 배양액은 10% heatinactivated fetal bovine serum(FBS: Gibco BRL, 26140-070)이 첨가된 TCM-199(Gibco BRL, 12340-030) 배양액에 1 μg/ml folicle stimulating hormone(FSH: Sigma, F-4021), 1 μg/ml estradiol-17β(Sigma, E-6253)을 첨가하여 사용하였다. 정자의 세정을 위한 배양액은 Sperm Tyrode Albumin Lactate Pyruvate Medium(Sp-TALP; Parish et al., 1988)를 사용하였고, 체외수정을 위한 배양액은 modified Tyrode Albumin Lactate Pyruvate Medium(Fer-TALP; Bavister and Yanagimachi, 1977)을 사용하였다. 초기배(2∼8세포기) 난자의 배양을 위한 배양액은 0.
- 경상남도 김해시 어방동에 소재한 김해 축산물 공판장에서 도축된 한우로부터 개체별로 채취한 난소를 난소 표면의 혈액과 이물질을 제거하고, 개체별로 번호를 붙인 폴리 아마이드팩에 담은 뒤 30∼3℃의 25 mg/ml gentamycin(Gibco, 15750-011)이 첨가된 0.9% 생리식염수가 들어있는 보온병에 담아, 도축 후 2∼4시간 이내 실험실로 운반하였다(Fig. 1).
- 체외수정용 정자는 농협중앙회 가축개량사업소에서 선정한 종모우 동결정액(—196℃)을 사용하였다.
데이터처리
- 통계적 유의성 검정은 SAS package program(version 8.0)의 GLM(General Linear Model)을 이용하여 분석하였고, 처리평균간 비교는 최소유의차 검정(LSD-test)을 통해 5%(p<0.05)일 때 유의하다고 판정하였다.
성능/효과
- 실험 기간 동안 총 1,761두 3,522개의 난소에서 31,038개의 난포란을 채취하였으며, 도체 육질등급별 채취한 각각의 난포란 수는 1++등급의 경우 총 278개 난소에서 2,639개로 평균 9.5개, 1+등급의 경우 418개 난소에서 3,949개로 평균 9.4개, 1등급의 경우 1,226개 난소에서 10,369개로 평균 8.5개, 2등급의 경우 1,224개 난소에서 10,770개로 평균 8.8개, 3등급의 경우 376개 난소에서 3,311개로 평균 8.8개로서, 육질등급 1++, 1+등급의 난소에서의 채취한 난포란 수가 육질등급 1, 2, 3등급보다 유의적으로 많았다(p<0.05).
- 1⁺⁺등급의 경우 2,639개의 난포란 중에서 1,482개가 수정되어 56.2%, 1⁺등급의 경우 3,949개의 난포란 중에서 2,279개가 수정되어 57.7%, 1등급의 경우 10,369개의 난포란 중에서 5,787개가 수정되어 55.8%, 2등급의 경우 10,770개의 난포란 중에서 6,333개가 수정되어 58.8%, 3등급의 경우 3,31개의 난포란 중에서 2,044개가 수정되어 61.7%로 나타났으며, 비록 3등급 유래 난포란의 체외 수정율이 가장 높았지만, 각 그룹간의 유의차는 인정되지 않았다(p<0.05).
- 본 연구(Table 1)에서는 호르몬 처리를 하지 않은 36∼48개월령 한우의 도축 후 평가되어진 육질등급 기준으로 1⁺⁺, 1⁺등급(비만) 유래 난포란에서 채란 수는 증가하였다.
- 이처럼 체지방 정도가 수정란의 발달능력에 있어서 부정적인 영향을 미친다는 유사한 연구보고가 많다. 본 연구에서 육질등급별 한우 난포란에서의 채란 수의 변화 이외의 결과(Table 2)중에서 경제적 가치가 높은 육질 1⁺⁺, 1⁺등급 유래 체외 수정란의 배 발달율이 낮았으며, 이것은 모체의 지방 정도가 체외 수정란의 발달능력에 영향을 끼친다는 것을 간접적으로 증명할 수 있는 자료이다.
- 본 연구 결과(Table 3)에서 육질등급별 체외 생산된 배반포의 품질(배반포의 세포 수)은 근내 지방도에 따른 유의적 차이는 없었다. 이것은 섭식 조절을 통한 비만 쥐 유래의 상실배와 배반포의 세포 수에서는 차이가 없었다는 Minge 등(2008)의 결과와 유사한 결과이다.
- 도축 후 한우의 육질등급(1⁺⁺, 1⁺, 1, 2, 3)별 회수한 난포란 수는 난소 1개당 각각 평균 9.5개, 9.4개, 8.5개, 8.8개, 8,8개로서, 1⁺⁺등급과 1⁺등급 그룹에서 유의하게 높았다(p<0.05).
- 본 연구의 결과를 요약하면 수정란 이식기술을 이용한 한우 개체별 난소 유래 난포란의 배반포의 체외생산 기법은 한우에서 유전자원의 보전 및 유전 형질의 개량 측면에서 충분히 활용이 가능하며, 농가의 경제적 차원에서 수정란 이식기술의 산업적 응용도 가능하다고 사료된다. 또한 본 연구결과에서 한우 도체 근내 지방 정도와 생식능력과의 연관성은 비만과 번식과의 관련 연구를 위한 하나의 효과적인 도구가 될 것이라 사료되며, 나아가서 이러한 연구 결과들은 비만과 난임과의 관련 연구를 위한 하나의 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 육질등급별로 체외 생산된 배반포의 품질 평가를 위해 TUNNEL asay 결과, 세포자연사 유래 사멸세포수의 비율은 1⁺⁺등급과 1⁺등급(각각 7.0%와 6.9%)그룹이 1등급, 2등급 및 3등급(각각 4.3%, 4.1% 및 4.3%) 그룹에 비해 높았지만, 유의차는 인정되지 않았다(p<0.05).
- 1⁺⁺ 등급, 1⁺등급 및 1등급에서 각각 53.5%, 52.1% 및 58.0%로서, 1등급 그룹이 다른 그룹에 비해 유의하게 높았다(p<0.05).
- 이상의 결과를 요약하면 수정란 이식기술을 이용한 한우 개체별 난소유래 난포란의 배양기술은 한우의 유전자원 보전과 유전 형질의 개량 측면에서 활용 가능한 방법이다. 그리고 한우 도체 육질등급과 생식능력과의 연관성은 비만과 번식과의 관련 연구를 위한 하나의 효과적인 도구가 될 것이라 사료되며, 나아가서 이러한 연구 결과들은 비만과 인간의 불임과의 연구에도 하나의 기초 자료가 될 수 있을 것이라고 사료된다.
후속연구
- 또한 종모우의 선발지수가 육질보다는 체형과 육량 위주로 되어 있어서 한우의 유전적인 육질 개량은 저조한 실정이다(조 등, 1992; 박 등, 2001). 따라서 한우 품종의 경쟁력 제고를 위해서는 육량이나 육질 등과 같은 경제적 형질이 우수한 개체를 선발, 관리하는 유전형질의 보존 측면과 이러한 개체를 계획 교배 등을 통해 유전적으로 개량하는 등의 다양한 측면에서 연구가 필요하다. 이러한 유전적인 개량 효율을 높이기 위한 지표로서는 세대간격(generation interval), 유전능력 평가의 정확도(selection accuracy), 선발강도(selection intensity), 유전적 다양성(genetic variabilty)등을 고려해야 하며, 개량의 효율을 높인다는 것은 일정기간 내에 보다 더 유전자 구성 변화를 중심으로 육종을 행해야 한다(Wu 등, 2012).
- 이처럼 혈장과 난포액과의 밀접한 연관성은 다른 수많은 연구(Leroy 등, 2005, Aardema 등, 2011)에서 보고되어지고 있다. 이러한 연구들을 종합하면 한우 모체의 근내지방 정도에 따라 혈액내의 각종 지방대사 관련 물질의 변화가 있을 것이며, 결국 난포액 내의 조성에도 영향을 미치며, 이것이 차후 체외수정란의 발달에 영향을 주는 하나의 원인일 수 있다. 한편, 렙틴, 아디포넥틴, 레지스틴 등은 지방에서 분비되는 대표적인 대사 호르몬이며, 이들은 에너지 대사에 있어 매우 중요한 조절인자로서 번식에 있어서 영양 공급의 조절과 관련되어 있다(Tersigni 등, 2011).
- 체지방의 증가는 지방세포에서 혈당 조절 대사 물질인 아디포넥틴과 레지스틴, 인슐린 등의 분비에 영향을 미쳐, 간헐적으로 혈액 내 글루코스 농도가 높아져서 미토콘드리아 작용을 과하게 하여 활성산소(Reactive oxygen species)가 증가하며, 이 활성산소는 DNA 손상, 미토콘드리아 대사 교란, 리소좀 파괴 등 문제를 일으킴으로써 apoptosis의 원인이 된다(Jiazhong 등, 2010). 따라서 이러한 요소들이 육질 1⁺⁺, 1⁺등급 한우 모체 유래의 배반포에 apoptosis 빈도를 높이는 주요 요인일 가능성(Cerri 등, 2009)이 있으며, 향후의 연구에서는 도체 근내 지방도에 따른 난포액 내의 다양한 대사 호르몬 등의 분석을 통해 명확한 원인을 밝힐 수 있을 것이라고 사료된다. 번식에 있어서 비만의 부정적인 측면의 수많은 연구 결과에도 불구하고, 그 상호관계에 대한 명확한 기전은 아직 불분명하다.
- 번식에 있어서 비만의 부정적인 측면의 수많은 연구 결과에도 불구하고, 그 상호관계에 대한 명확한 기전은 아직 불분명하다. 렙틴, 아디포넥틴, 레지스틴의 분비 변화, 혈장 내 불포화 지방산과 각종 사이토카인의 농도 변화, 스테로이드 대사 변화, 시상하부-뇌하수체-난소 간의 소통장애 등 다양한 측면으로의 연구가 논의되어지고 있지만, 그 상호 작용간의 매우 높은 복잡성은 비만과 번식과 상호관련 기전에 명확한 해석이 없기 때문에 이 부분에 대한 심도 깊은 지속적인 연구의 필요성을 요구한다.
- 이것은 아마도 수정란 이식자의 숙련된 기술과 경험, 그리고 수란우의 선정과정의 차이라고 생각한다. 다만 본 연구에서 육질등급이 높은 1⁺⁺, 1⁺ 등급 유래 배반포의 임신율이 1등급 유래의 것보다 낮았다는 것은 앞에서 설명했듯이 모체의 지방과 난자의 발생능력과의 연관 가능성을 생각할 수 있으며, 앞으로 육질 2등급 또는 3등급 유래 체외 수정란의 이식결과에 따라 더욱 명확해질 것이라고 사료되며, 더욱이 가축개량측면에 있어서 모체 육질 등급별 산자의 육질 등급을 조사함으로써 그 유전적 개량 효율의 명확한 측정이 가능할 것이다. 그렇지만 도축장에서 무작위로 채취한 난소유래 난자를 이용한 수정란 이식은 번식 효율 측면에서는 매우 유용할지 몰라도 전체적인 가축 개량의 의미에서는 마이너스적인 요소로 작용할 가능성이 있기 때문에 차후 수정란 이식 기술을 보다 개선해야 할 것이라고 생각한다.
- 다만 본 연구에서 육질등급이 높은 1⁺⁺, 1⁺ 등급 유래 배반포의 임신율이 1등급 유래의 것보다 낮았다는 것은 앞에서 설명했듯이 모체의 지방과 난자의 발생능력과의 연관 가능성을 생각할 수 있으며, 앞으로 육질 2등급 또는 3등급 유래 체외 수정란의 이식결과에 따라 더욱 명확해질 것이라고 사료되며, 더욱이 가축개량측면에 있어서 모체 육질 등급별 산자의 육질 등급을 조사함으로써 그 유전적 개량 효율의 명확한 측정이 가능할 것이다. 그렇지만 도축장에서 무작위로 채취한 난소유래 난자를 이용한 수정란 이식은 번식 효율 측면에서는 매우 유용할지 몰라도 전체적인 가축 개량의 의미에서는 마이너스적인 요소로 작용할 가능성이 있기 때문에 차후 수정란 이식 기술을 보다 개선해야 할 것이라고 생각한다.
- 본 연구의 결과를 요약하면 수정란 이식기술을 이용한 한우 개체별 난소 유래 난포란의 배반포의 체외생산 기법은 한우에서 유전자원의 보전 및 유전 형질의 개량 측면에서 충분히 활용이 가능하며, 농가의 경제적 차원에서 수정란 이식기술의 산업적 응용도 가능하다고 사료된다. 또한 본 연구결과에서 한우 도체 근내 지방 정도와 생식능력과의 연관성은 비만과 번식과의 관련 연구를 위한 하나의 효과적인 도구가 될 것이라 사료되며, 나아가서 이러한 연구 결과들은 비만과 난임과의 관련 연구를 위한 하나의 기초 자료가 될 수 있을 것이다.
- 이상의 결과를 요약하면 수정란 이식기술을 이용한 한우 개체별 난소유래 난포란의 배양기술은 한우의 유전자원 보전과 유전 형질의 개량 측면에서 활용 가능한 방법이다. 그리고 한우 도체 육질등급과 생식능력과의 연관성은 비만과 번식과의 관련 연구를 위한 하나의 효과적인 도구가 될 것이라 사료되며, 나아가서 이러한 연구 결과들은 비만과 인간의 불임과의 연구에도 하나의 기초 자료가 될 수 있을 것이라고 사료된다.
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