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문제 정의
- 본 연구는 살아있는 세포막을 통과하기 어려운 DAPI를 대신해서 핵산을 염색하기 위해 Hoechst 33258 이용 성세포의 발생 정도를 평가하기 위한 방법을 개발하고자 시도하였고, 결과로 웅성 성세포 간편 분류지표를 제시하였다. 이를 생체 내 정자의 발생과정에 적용하여 적정성을 조사하였던 바, 생쥐의 생후 일령과 정자발생의 시기는 깊은 상관관계가 있다는 것을 밝힐 수 있었다.
제안 방법
- 핵이식 또는 체외수정 등 수정에 사용 가능한 발생단계인 정자양세포 또는 정자까지 정원세포를 체외배양하기 위해서는 배양환경의 개선 못지않게 배양하고 있는 세포의 발생단계를 구별하고, 적정시기에 활용할 수 있어야 한다. 따라서 본 연구에서는 신속하면서 생존에 영향을 미치지 않으며, 정자의 발생단계를 추정할 수 있는 방법을 개발코자 하였으며, 이를 위해 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 Hoechst 33258을 이용 웅성 성세포를 형광염색하고, 발생단계별 형태적 특징을 조사하여 웅성 성세포 분류기준을 설정한 다음, 다양한 일령의 생쥐로부터 채취한 정소세포를 형광염색한 후 앞서 제시한 기준을 적용하여 발생단계별로 분류하면서 본 연구에서 제시하고 있는 성세포분류기준의 적정성을 검정하였다.
- 반복 세척하여 회수한 정소세포 용액에 들어있는 세포수를 혈구계산기를 이용하여 측정하였으며, trypan blue 생사염색(Somfai 등, 2002)을 통해 세포의 생존 여부는 조사하였다. 특히 생사염색에서 세포의 생존율이 90% 이상인 시료만 실험에 공시하였다.
- 본 연구에서 실아 있는 세포에서도 사용 가능한 Hoechst 33258 이용 형광염색을 실시하고, 발생단계별 성세포의 형태적 및 구조적 특징을 조사하였다, 형광 특성에 따라 성세포를 분류하는 기준을 설정하고, 이러한 분류기준이 웅성 생쥐의 정소세포의 분류에 효율적이고 적정한 지를 조사하였던바 얻어진 결과는 다음과 같다.
- 정소로부터 회수한 세포를 PBS로 희석한 다음 1,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 세척하고, 동일한 방법으로 정자를 한 번 더 세척한 다음, 실온에서 Hoechst 33258 용액으로 도포하고, 암실에서 30분간 방치하여 염색을 유도한 후 핵과 핵인 등을 형광현미경(Leica Co., Germany)으로 관찰하였다.
- 정소세포의 처리에 사용되는 DMEM 배양용액은 DMEM에 penicillin/streptomycin 용액과 NEAA 용액을 각각 1% 및 ×1이 되도록 희석 첨가하여 제조하였다.
- 정원세포, 정자세포, 정자양세포 및 정자를 포함하는 성세포와 세르톨리세포를 포함한 체세포의 형태학적 특성을 형광염색을 통해 조사하고, 이를 바탕으로 새로운 웅성 성세포의 분류기준을 제안하였다.
- 출생 후 35일령까지의 신생 생쥐를 실험목적에 따라 1∼5마리로부터 외과적 방법으로 정소를 채취한 다음 PBS로 세척하고, 정소백막을 제거하였다.
- 한편, 제안된 분류기준을 각기 다른 일령의 생쥐로부터 회수한 성세포의 발생단계를 구분하는데 적용하여, 제안된 성세포의 형광염색 분류기준이 적정한지를 검정하였다.
- 형광염색을 통해 조사된 정자발생 단계별 형광특성 중에서 성세포의 단계별 분류기준으로 사용할 주요 특징을 정리하였으며, 결과는 Table 1과 같다.
- 25% trypsin/EDTA 용액에서 15분간 배양하여 정소조직의 소화를 유도하였다. 효소에 의한 소화 작용을 중지시키기 위해 10% FBS 함유 DMEM 용액을 정소조직 소화용액에 1:1 비율로 첨가하였다. 효소 반응이 중지된 세포 부유 용액을 25 μm 공극의 nylon mesh에 통과시켜 커다란 입자 및 세포덩어리를 제거한 다음, 회수한 용액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고, 세포펠렛을 회수하였다.
대상 데이터
- (경기도, 한국)에서 구입하였으며, 10:14시간 명암주기, 50%±10% 습도 및 23±2℃ 온도로 조건화된 환경에서 사육하면서 물과 사료(AIN 93 G; Feedlab Co., 경기도, 한국)를 충분히 공급하였다.
- 배양액 제조를 위해 검정된 시약을 구매하여 사용하였으며, 주요 시약은 다음과 같다; Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM, Thermo, SH30243.01, Thermo Fisher Scientific Inc.), penicillin/streptomycin(Gibco, 15140, Thermo Fisher Scientific Inc.), heat-inactivated fetal bovine serum(FBS, JRS, 43640, J R scientific. Incs), bovine serum albumin(BSA, Sigma, A9418, Sigma-Aldrich Co.), collagenase type IV(Sigma, C5138, Sigma-Aldrich Co.), 0.25% trypsin/EDTA solution(Gibco, 12605, Ther-mo Fisher Scientific Inc.), MEM non-essential amino acids(NEAA. Sigma, M7145, Sigma-Aldrich Co.), Hoechst-33258(Sigma, H-6024, Sigma-Aldrich Co.), phosphate buffered saline(PBS, Gibco, 10010023, Thermo Fisher Scientific Inc.).
- , 경기도, 한국)를 충분히 공급하였다. 본 실험은 경북대학교 실험동물 사용윤리규정에 의해 제정된 경북대학교 실험동물 사용지침서를 준수하여 진행하였다.
- 정소세포를 형광염색하기 위해 사용되는 Hoechst 33258 용액은 Hoechst 33258의 최종농도가 20 μg/ml가 되도록 PBS로 용해하여 제조하고, 0.5 ml씩 분주하고 사용 시까지 —20℃에서 냉동 보관하였다.
데이터처리
- 측정된 자료들은 dBSTAT for window 4.0(software, dBSTAT, 대한민국)을 이용 통계 분석하였는데, 각 처리에 대한 평균과 표준편차 및 처리 간 차이의 유의성은 일원분산분석(One-way ANOVA)을 이용 산출하였으며, 차이의 유의수준은 P<0.05로 설정하였다.
이론/모형
- 실험에 공시할 정소세포는 Guan 등(2009)의 방법을 준용하여 분리 회수하였으며, 요약하면 다음과 같다.
성능/효과
- 1. 정원세포는 핵의 크기와 모양 및 핵 내 형광반점의 수에 있어서 정자세포와 구분할 수 있었으며, 이들보다 핵이 크기가 매우 작은 정자양세포는 핵의 용적과 모양 및 꼬리의 형광 유무에 있어서 정자와 차이가 있었다.
- 2. 이러한 형광염색의 특징을 고려해서 성세포의 분류기준을 설정하고, 웅성 생쥐의 정소세포를 대상으로 이 기준의 효율성과 적정성을 검정하였을 때 유의한 결과를 얻었다. 한편, 출생 후 춘기발동기 및 성 성숙기에서 웅성성세포의 분화와 발생이 급격히 이루어지는 것을 관찰할 수 있었다.
- 결론적으로 본 연구에서 제시한 형광염색을 이용한 성세포의 분류 방법은 발생 중인 성세포의 발생단계를 규정하는데 있어서 간단하면서 적정하며 효율적인 것으로 사료된다.
- 결론적으로, 본 연구에서 제시한 Hoechst 33258 형광염색을 이용한 성세포 분류기준은 정자발생 연구를 위해 간단하면서 신뢰할 수 있는 것으로 사료된다.
- 그리고 핵인이 세포질에 인접된 정자양세포에서는 응축되고 신장된 핵의 형광을 관찰할 수 있었고(Fig. 1, h’), 곧고 짧은 꼬리를 지닌 정자양세포(Fig. 1, i’)에서는 거의 정자에서만 볼 수 있는 핵의 형태를 지니고 있었으나, 꼬리부분에서는 형광을 관찰할 수 없었다.
- 대부분 정원세포의 크기에 따라 핵의 크기에 차이가 있었고, 구형인 핵 속에 핵질보다 진하게 형광을 나타내는 반점의 수에 차이가 있었는데(Fig. 1, a’), 주로 2∼3개 정도의 형광반점이 관찰되었다(Fig. 1, b’과 c’).
- 생쥐 정소에서 각 발생단계의 성세포 출현시기와 이후 변화를 살펴보면, 정원세포는 생후 8일령까지 유일한 성세포로서 출생 후 8일까지 증가하다가 이후 35일까지 지속 감소하였다. 정자세포는 생후10일경 출현하여 이후 생후 28일까지 증가하다가 감소하였으며, 정자양세포는 생후 21일경에 출현한 다음 이후에 지속 증가하였고, 정자는 생후 35일경에 비로서 출현하였다.
- 예로서, 출생 후 생쥐의 일령이 증가하면서 정원세포와 정자세포의 수는 증가하는 반면, Sertoli 세포를 포함하는 기타 세포의 비율이 점차 감소하였으며, 특히 춘기발동기가 개시되는 3주령부터 기타 세포의 비율이 현저히 감소하였다. 이는 출생 이후 정원줄기세포의 자가 재생과 정자세포로의 지속적인 분화발생 및 Sertoli세포의 안정화에 기인한 결과로 사료된다.
- 본 연구는 살아있는 세포막을 통과하기 어려운 DAPI를 대신해서 핵산을 염색하기 위해 Hoechst 33258 이용 성세포의 발생 정도를 평가하기 위한 방법을 개발하고자 시도하였고, 결과로 웅성 성세포 간편 분류지표를 제시하였다. 이를 생체 내 정자의 발생과정에 적용하여 적정성을 조사하였던 바, 생쥐의 생후 일령과 정자발생의 시기는 깊은 상관관계가 있다는 것을 밝힐 수 있었다.
- 춘기발동기인 생후 21일령에는 정소세포 중에서 정자세포가 현저히 증가하였고, 정자양세포도 출현하였다. 이후 생후35일령에 정자양세포의 비율은 지속 증가하여 최고치에 도달하였으며, 이때 정자가 출현하는 것이 관찰되었다.
- 정자(spermtatozoon)에서는 정자양세포에 비해 길게 신장된 두부에 더욱 강한 형광반점이 나타났으며(Fig. 1, j’과 k’), 후기 정자양세포와 달리 미토콘드리아가 미부의 중편부에서도 뚜렷한 형광을 볼 수 있었다(Fig. 1, l’).
- 생쥐 정소에서 각 발생단계의 성세포 출현시기와 이후 변화를 살펴보면, 정원세포는 생후 8일령까지 유일한 성세포로서 출생 후 8일까지 증가하다가 이후 35일까지 지속 감소하였다. 정자세포는 생후10일경 출현하여 이후 생후 28일까지 증가하다가 감소하였으며, 정자양세포는 생후 21일경에 출현한 다음 이후에 지속 증가하였고, 정자는 생후 35일경에 비로서 출현하였다. 세르톨리세포를 포함한 체세포의 비율은 출생 후 지속적으로 감소하였다.
- 한편, 이 시기는 춘기발동기 직전으로 성선자극호르몬이 감소하는데, 이 호르몬의 감소는 성세포의 분화 발생에 필요한 자극의 감소를 의미한다. 즉, 성장하는 정소에서 기타 세포의 수적 증가에 비해 정원세포와 정자세포 즉 성세포의 수적 증가가 상대적으로 크지 않았으며, 따라서 10일령에 비해 14일령에는 기타 세포의 백분율이 증가한 것으로 사료된다.
- 즉, 정원세포로부터 발생한 정자세포는 상대적으로 더 큰 핵과 많은 형광반점을 가지고 있었으며, 이들보다 핵의 크기가 뚜렷이 작고 단일 형광반점을 가지고 있는 정자양세포의 경우, 핵이 거의 응축되어 있고, 상대적으로 강한 형광반점을 보여주는 정자와 구분할 수 있었으며, 특히 정자 형태 형성이 거의 완료된 경우 정자의 경우 미부에서 형광이 나타났다.
- 세르톨리세포를 포함한 체세포의 비율은 출생 후 지속적으로 감소하였다. 출생 후 일령이 증가하면서 전체적으로 성세포 비율의 증가하였고, 기타 체세포 비율은 감소하였으며, 특히 춘기발동기가 시작되는 생후 21일경에 기타 세포 비율이 현저히 감소하였고, 성 성숙시기인 35일령에서는 더욱 감소하였다.
- 이러한 형광염색의 특징을 고려해서 성세포의 분류기준을 설정하고, 웅성 생쥐의 정소세포를 대상으로 이 기준의 효율성과 적정성을 검정하였을 때 유의한 결과를 얻었다. 한편, 출생 후 춘기발동기 및 성 성숙기에서 웅성성세포의 분화와 발생이 급격히 이루어지는 것을 관찰할 수 있었다.
- 형광염색을 이용해 세포의 단계를 구분하려고 시도한 본 연구에서 성세포가 분화 발생하는 동안 핵의 수와 모양에서 다양한 형태를 관찰할 수 있었다. 즉, 정자발생 과정에서 핵의 형태와 핵인의 수에서 변화가 일어났는데, de França 등(1995)은 정자발생 동안에 일어나는 핵을 포함한 세부구조의 변화를 특성화하면서 이들은 기능의 변화와 관련이 있다고 보고한 바 있다.
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