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제안 방법
- 개인 간 뇨 농도 차이에 따른 뇨 돌연변이 영향을 최소화하기위해 Creatinine assay kit(R&D system)를 사용하여 뇨 중 크레아티닌 함량을 분석한 다음 보정하였다.
- 우선 대표적인 돌연변이원성 물질인 Benzo[a]pyrene, 2-Aminonaphthalene, 2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAα C) 그리고 담배연기 고체상 분획(TPM)를 이용하여 세 종류의 Salmonella typhimurium(TA98, TA100, YG1024) 균주로부터 가장 민감도가 높은 YG1024를 선정하였다. 그리고 민감도 향상을 위해 균주 수, 대사활성효소계 농도, 전배양 시간 등 시험 조건들을 확립하였다. 또한 C18 컬럼을 활용하여 전처리 과정을 효율화함으로써 90% 이상의 회수율을 확인하였다.
- 담배연기 입자상 성분(TPM)은 표준담배 (Kenturky reference cigarette : 3R4F) 20개피를 자동흡연장치(Heinr Borgwaldt RM20/CS : Germany)를 이용하여 CORESTA 표준흡연조건 (puff volume : 35 mL, puff frequency : 60 sec, puff duration : 2 sec)하에서 연소시키고, 92 mm cambridge filter pad를 이용하여 포집하였다. 적당량의 DMSO를 사용하여 filter pad로부터 TPM을 추출해서, 농도가 10 ㎎/mL이 되도록 한 후 -70℃에 보관하면서 시험에 사용하였다.
- 대사활성효소계 존재 하에서 대표적인 돌연변이원성 물질들에 대한 균주별 활성도를 비교하기 위해 Polycyclic aromatic hydrocarbon류 중 B(a)P, Aromatic amine류 중 2-Aminonaphthalene, Heterocyclic amine류 중 MeAaC를 선택하여 담배 연기 입자상 성분(TPM)과 함께 돌연변이성을 측정한 결과, B(a)P를 제외한 모든 물질에서 YG1024 균주의 민감도가 높아 뇨 돌연변이 유발성 시험 균주로 선정하였다(Fig. 1).
- 균주 수 실험결과, 4 ×108개 처리시 2 × 108보다 민감도가 높았으나, 자연발생 집락수가 정상범위(30 - 50/plate)를 벗어나, 적정 개수로 2 × 108개로 설정하였고, 대사활성효소계 농도는 기존 plate incoporation(19%) 보다 낮은 9 %에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 마지막으로 전배양 시간별 시험결과, 활성 차이는 유의하지 않지만, 40분 배양이 가장 높은 활성을 보여 배양 시간을 40분으로 설정하였다.
- 복귀돌연변이 시험 결과는 시료로부터 각 농도군 3개의 평판으로부터 얻은 집락 수의 평균±표준편차와 용량상관성이 나타나는 초기농도 범위에서 구해진 기울기 값을 이용해서 계산된 활성도 값 (Specific activity, revertants/mg TPM 또는 revertants/cig.)을 표시하였다.
- 본 실험에서는 1 ㎛ pore size의 glass microfiber filter로 여과한 뇨 시료를 C18 column(Varian Megabond, 2 g)을 이용하여 200배로 농축하였다. C18 column은 상업적인 제품으로서 유기화합물의 분리․정제에 전통적으로 많이 사용되는 XAD-2 resin 보다 측정오차가 작고 정제효율이 높아 microsuspension assay에서 민감도가 높다고 알려져 있으며(Granella M and Clonfero E.
- 본 실험에서는 microsuspension assay시 영향을줄 수 있는 균주 수, 대사활성효소계 농도, 전배양 시간 등의 적정조건 등을 설정함으로서 최적 반응 조건을 확립하였다(Fig. 3). 균주 수 실험결과, 4 ×108개 처리시 2 × 108보다 민감도가 높았으나, 자연발생 집락수가 정상범위(30 - 50/plate)를 벗어나, 적정 개수로 2 × 108개로 설정하였고, 대사활성효소계 농도는 기존 plate incoporation(19%) 보다 낮은 9 %에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
- 본 실험에서는 적정균주를 선정하고 전처리 조건을 수정 및 보완함으로써 돌연변이원성물질들에 대한 노출량 생체지표로써 최적의 뇨 돌연변이 유발성 실험방법을 확립하였다.
- 뇨 돌연변이 유발성은 인체 내 돌연변이원성 물질들에 대한 노출량을 평가하는 유용한 생체지표이다. 본 연구에서는 일반적인 Ames test 대신 고감도 돌연변이 시험법(microsuspension assay)를 이용 하여 뇨 돌연변이 유발성에 영향을 미치는 다양한 인자들을 최적화하였다. 우선 대표적인 돌연변이원성 물질인 Benzo[a]pyrene, 2-Aminonaphthalene, 2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAα C) 그리고 담배연기 고체상 분획(TPM)를 이용하여 세 종류의 Salmonella typhimurium(TA98, TA100, YG1024) 균주로부터 가장 민감도가 높은 YG1024를 선정하였다.
- 1 mL을 혼합하여 37 ℃에서 40분간 진탕 배양한 다음, 고압증기 멸균한 top agar 2 mL을 혼합하고 즉시 vortex mixer로 2-3초간 진탕하여 minimal glucose agar plate에 부어 여러 방향으로 기울여 고루 퍼지게 하여 굳게 하였다. 음성대조군(부형제)은 시험물질 용액 대신부형제 0.1 mL을, 양성대조군은 양성대조물질을 같은 방법으로 가하여 실시하였다. Top agar가 굳은 후 플레이트 뚜껑을 닫은 상태에서 플레이트를 뒤집어 37 ℃에서 약 48시간 배양 후 집락을 계수 하였다.
- 제한된 양의 뇨 시료로부터 돌연변이성을 측정 하기 위해서는 민감도가 높은 균주를 선발해야 하므로 돌연변이 유발 기전에 따라 대표적인 균주 3종, TA98(격자이동 돌연변이형), TA100(염기치환 돌연변이형), YG1024(O-acetyltransferase 과발현 균주)을 선택하여 돌연변이 유발성 민감도를 측정 하였다.
- 2) 에 접종해 shaking incubator를 이용하여 37 ℃에서 약 10시간 배양한 후 사용하였다. 최소배지 (minimal agar plate)는 1.5 % Bacto agar와 Vogel-bonner medium E 및 2 % glucose를 함유하도록 만들었고 Top agar는 0.6 % agar와 0.5 % NaCl로 조제하였으며, top agar에는 0.05 mM의 histidine-biotin을 첨가하였다.
대상 데이터
- Dimethylsulfoxide(DMSO), 2-Aminoanthracene (2AA), Benzo[a]pyrene, 2-Aminonaphthalene, 2-Amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAα C), Bacto agar, Sodium chloride(NaCl), Glucose, L-histidine/D-biotin는 Sigma-aldrich Company(St Louis, USA) 제품을 사용하였다.
- 다양한 환경적, 대사적 요인을 가진 성인남성(총 7명)으로부터 24시간 뇨를 수집하여 균질하게 잘 섞은 후 실험 전까지 -70 ℃ 보관하였다.
- 으로부터 구입하였다. 대사활성효소계 (S-9 Mix)에 사용된 S-9(aroclor 1254-induced rat liver)와 cofactor는 각각 Mol-Tox(Boone, NC, USA)와 Wako(Osaka, Japan)에서 구입하였고, 그밖에 Methanol, Acetonitrile 용매는 Merck (Darmstadt Germany)로부터 구입하였다.
- 우선 대표적인 돌연변이원성 물질인 Benzo[a]pyrene, 2-Aminonaphthalene, 2-amino-3-methyl-9H-pyrido[2,3-b]indole(MeAα C) 그리고 담배연기 고체상 분획(TPM)를 이용하여 세 종류의 Salmonella typhimurium(TA98, TA100, YG1024) 균주로부터 가장 민감도가 높은 YG1024를 선정하였다.
데이터처리
- 돌연변이 유발성에 대한 시료들 간의 유의적인 차이(p<0.05)는 SPSS 프로그램의 선형회귀분석을 통해서 구해진 각각의 시료들에 대한 활성도 값에 대한 일원분산분석 (ANOVA)과, 사후분석으로는 Duncan test를 이용 하여 검증하였다.
이론/모형
- 복귀돌연변이 시험은 Maron과 Ames(1983)의 방법을 변형한 고감도 Ames test(microsuspension assay) 방법을 사용하였고, 특정성분들에 대한 돌연변이 유발성 검색을 위해서 Salmonella typhimurium 균주를 사용하였다.
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