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문제 정의
- 본 연구에서는 바이오센서 제작에 우수한 장점을 가지고 있는 다이아몬드 필름 위에 전하 검출형 SGFETs 를 제작하고 고감도 SNPs 검출 방법을 제시하였다. SNPs를 고감도로 검출하기 위하여 타게트 DNA hybridization 공정에서 다이아몬드 SGFETs 전극에 음 전압을 인가하였으며 이로 인해 음전압을 인가하지 않은 경우 대비 상대적으로 높은 감도로 SNPs를 검출하였다.
- DNA의 단일염기 다형성(SNPs)을 검출하는 방법은 다양한 방법으로 시도되어 왔으며 현재에도 많은 연구가 진행되고 있다. 본 연구에서는 전하 검출형 다이아몬드 SGFETs를 이용하여 SNPs를 검출하는 방법으로 전기적 바이어스 방법을 제시하였다. 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 표면에 고정된 특정 염기 배열의 프로브 DNA와 타게트 DNA의 hybridization 공정에서 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극에 음 전압(-0.
제안 방법
- 3× SSC용액에 보관한 프로브 DNA를 고정하기 위하여 20 μM 농도의 프로브 DNA 50 ㎕ 용액을 다이아몬드 SGFETs 게이트 표면에 드롭한 후 38℃의 항습 챔버 안에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 2시간 후 게이트 채널위에 물리적으로 흡착한 프로브 DNA를 제거하기 위하여 워싱 버퍼용액(PBS, 0.1% Tween-20)으로 1번, PBS용액으로 1번, 순수한 물을 이용하여 1번 세정하였다.
- 3× SSC용액에 보관한 프로브 DNA를 고정하기 위하여 20 μM 농도의 프로브 DNA 50 ㎕ 용액을 다이아몬드 SGFETs 게이트 표면에 드롭한 후 38℃의 항습 챔버 안에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다.
- 40분 후 물리적 흡착된 타게트 DNA를 세정하기 위하여 2× SSC(0.2% SDS포함) 용액, 2× SSC 용액 및 0.2× SSC 용액에서 각각 5분 동안 세정하였다.
- 따라서 각 DNA의 11-mer 음전하가 용액속 양이온에 중화되지 않고 다이아몬드 게이트 채널에 영향을 준다[12]. SGFETs 측정 조건으로는 드레인-소스 전압(VDS)를 -0.1 V로 고정하고 -5㎂ 크기의 드레인-소스 전류(IDS)가 흐르기 위한 게이트-소스(VGS) 전압 크기를 측정하여 타게트 DNA hybridization 여부를 검출하였다.
- 본 연구에서는 바이오센서 제작에 우수한 장점을 가지고 있는 다이아몬드 필름 위에 전하 검출형 SGFETs 를 제작하고 고감도 SNPs 검출 방법을 제시하였다. SNPs를 고감도로 검출하기 위하여 타게트 DNA hybridization 공정에서 다이아몬드 SGFETs 전극에 음 전압을 인가하였으며 이로 인해 음전압을 인가하지 않은 경우 대비 상대적으로 높은 감도로 SNPs를 검출하였다.
- 7 nm)를 통해 이루어 졌다. UV 챔버내 불순물 가스를 제거하기 위하여 질소 가스(N2)를 이용 배기를 5회 반복 하였으며 이 후 암모니아 가스를 5분 동안 주입하고 UV를 조사하였다. 4시간 동안 암모니아 가스 분위기에서 UV 처리한 다이아몬드 SGFETs 게이트 채널 표면의 아민기(-NH2) 비율은 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)를 이용하여 분석한 결과 16%이었다.
- 그러나 본 연구에서 새롭게 제안하는 고감도 SNPs 검출을 위한 전기적 바이어스를 인가하는 방법에서는 타게트 DNA hybridization 공정 시 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극에 기준전극 대비 –0.3 V를 인가하는 조건에서 DNA hybridization을 진행하였다.
- 본 연구에서는 전하 검출형 다이아몬드 SGFETs를 이용하여 SNPs를 검출하는 방법으로 전기적 바이어스 방법을 제시하였다. 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 표면에 고정된 특정 염기 배열의 프로브 DNA와 타게트 DNA의 hybridization 공정에서 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극에 음 전압(-0.3V)을 인가함으로써 상보적 타게트 DNA(cDNA) 및 1-염기 차(1MM-DNA) 타게트 DNA의 hybridization 효율성 제어를 통해 타게트 cDNA와 1MM-DNA를 기존 검출 방식 대비 고감도로 검출하였다. 본 방법은 전해질 용액에서 넓은 전위창을 갖고 있으며 물리적-화학적 안정성이 우수한 다이아몬드 기판에서 가능하며 이러한 전기적 바이어스를 이용한 방법은 정성적 및 정량적 제어가 가능하여 효율적으로 다양한 SNPs 검출에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 다이아몬드 필름위 SGFETs는 다이아몬드 표면의 p형 전도성을 이용하기 위하여 표면 수소 처리된 다이아몬드 필름 위에 제작하였다. 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극 및 소스 전극의 와이어 본딩 시 ohmic 접촉을 위하여 각 드레인 전극 및 소스 전극에 금을 증착하였다. 금이 증착된 각 전극의 와이어 본딩은 실버 페이스트를 이용하였으며 와이어 본딩 된 드레인 전극과 소스 전극은 에폭시 처리를 통해 전해질 용액으로부터 보호하였다.
- 다이아몬드 필름위 SGFETs는 다이아몬드 표면의 p형 전도성을 이용하기 위하여 표면 수소 처리된 다이아몬드 필름 위에 제작하였다. 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극 및 소스 전극의 와이어 본딩 시 ohmic 접촉을 위하여 각 드레인 전극 및 소스 전극에 금을 증착하였다.
- 마이크로 패턴 내부는 프로브 DNA를 고정하기 위하여 암모니아 가스 분위기에서 UV 조사를 통해 아민기(-NH2)를 형성하였으며, 패턴 외부는 DNA의 물리적 흡착을 최소화하기 위하여 불소 가스(C3F8) 분위기에서 플라즈마 처리(-F)를 하였다[12].
- 상기 공정을 통해 다이아몬드 채널 표면위 프로브 DNA 고정 및 타게트 DNA hybridization 여부는 타게트 cDNA의 5' 말단에 Cy 5 형광물질을 부착하고 마이크로 형광 패터닝을 이용 확인하였다.
- 이를 통해 본 연구에서 사용하는 DNA 고정 및 hybridization 방법이 다결정 다이아몬드 기판에서 문제가 없음을 확인하였다. 이와 동일한 공정으로 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 표면에서 프로브 DNA 고정 및 타게트 DNA hybridization을 진행하였다.
- 전하 검출방식의 다이아몬드 SGFETs를 이용한 cDNA 및 1MM-DNA 검출은 PBS 버퍼용액(NaCl 농도 10 mM)에서 FETs의 전기적 신호 측정 방법을 이용하였으며 PBS버퍼 용액의 Debye length는 3 nm이다[7]. 본 논문에 사용한 DNA는 21-mer를 사용하였으며 DNA의 길이는 6 nm이다.
- 전하 검출형 다이아몬드 SGFETs DNA 센서를 이용 cDNA와 1MM-DNA의 검출 감도를 높이기 위하여 타게트 DNA hybridization 공정 과정에서 음 전압(–0.3 V)을 인가하였다.
- 증착된 다결정 다이아몬드 필름의 두께는 8 ㎛이다. 증착된 다결정 다이아몬드 필름은 표면 수소 처리를 진행하기 위해 수소 가스(99.999%, 396 s.c.c.m)를 챔버 안에 주입 후 플라즈마 처리를 통해 표면 수소 처리를 진행하였다. 표면이 수소 처리된 다이아몬드 표면은 별도의 불순물 주입 없이 p형 표면 전도성(10-20 ㏀/sq)을 나타낸다[6]
- 평가 방법으로는 타게트 DNA가 없는 2× SSC(0.2% SDS포함) 버퍼 용액에서 DNA hybridization 검출 방법과 동일하게 다이아몬드 SGFETs의 드레인 전극에 음 전압(-0.3 V)을 인가하고 임의의 시간에 트랜지스터를 버퍼 용액에서 꺼내 세정 후 PBS 버퍼용액(NaCl 농도 10 mM)에서 타게트 DNA 검출과 동일한 조건(VDS =-0.1 V, IDS = -5 ㎂로 고정)하에서 10분, 20분, 30분, 40분에 각각 VGS를 측정하였다.
- 프로브 DNA가 고정된 다이아몬드 SGFETs 게이트 채널위에서 상보적(cDNA) 및 1-염기 차 (1-mer mismatched; 1MM-DNA) 타게트(target) DNA hybridization은 2× SSC(0.2% SDS포함) 용액에 보관한 100 nM 농도의 타게트 DNA 1 ㎖ 용액을 드롭한 후 실온(25℃) 에서 40분 동안 인큐베이션 하였다.
- 프로브 DNA를 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 위에 고정하기 위하여 기능성 링커(glutaraldehyde, 1%)를 1시간 동안 처리 후 순수한 물을 이용하여 3번 세정하였다. 3× SSC용액에 보관한 프로브 DNA를 고정하기 위하여 20 μM 농도의 프로브 DNA 50 ㎕ 용액을 다이아몬드 SGFETs 게이트 표면에 드롭한 후 38℃의 항습 챔버 안에서 2시간 동안 인큐베이션 하였다.
대상 데이터
- . 본 논문에 사용한 DNA는 21-mer를 사용하였으며 DNA의 길이는 6 nm이다. 따라서 각 DNA의 11-mer 음전하가 용액속 양이온에 중화되지 않고 다이아몬드 게이트 채널에 영향을 준다[12].
- 본 실험에 사용한 DNA는 Sigma Genosys에서 구입한 21-mer 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 사용하였으며 각 DNA 스퀜스는 다음과 같다.
- 금이 증착된 각 전극의 와이어 본딩은 실버 페이스트를 이용하였으며 와이어 본딩 된 드레인 전극과 소스 전극은 에폭시 처리를 통해 전해질 용액으로부터 보호하였다. 실험을 위해 제작한 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 길이는 500 ㎛, 채널 폭은 8 ㎜이다.
- 수소 처리된 다이아몬드 기판를 부분적으로 아민기 처리한 다이아몬드 기판은 p 형 전도성을 나타내며 표면저항 값은 전면이 수소 처리된 다이아몬드 기판 대비 아민기 비율과 비례하여 증가한다[12]. 전해질 용액내에서 기준 전극으로는 Ag/AgCl 전극을 사용하였다.
- 다결정 다이아몬드 필름은 p형 실리콘(100) 기판위에 MPCVD(microwave plasma chemical vapor deposition) 방법을 이용하여 증착하였다. 증착을 위하여 수소 가스(99.999%, 396 s.c.c.m)와 메탄 가스(99.999%, 4 s.c.c.m)를 사용하였으며 압력은 45 torr, 파워는 1.2 kW, 기판 온도는 840℃조건하에서 12시간 동안 증착하였다. 증착된 다결정 다이아몬드 필름의 두께는 8 ㎛이다.
이론/모형
- 다결정 다이아몬드 필름은 p형 실리콘(100) 기판위에 MPCVD(microwave plasma chemical vapor deposition) 방법을 이용하여 증착하였다. 증착을 위하여 수소 가스(99.
성능/효과
- UV 챔버내 불순물 가스를 제거하기 위하여 질소 가스(N2)를 이용 배기를 5회 반복 하였으며 이 후 암모니아 가스를 5분 동안 주입하고 UV를 조사하였다. 4시간 동안 암모니아 가스 분위기에서 UV 처리한 다이아몬드 SGFETs 게이트 채널 표면의 아민기(-NH2) 비율은 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS)를 이용하여 분석한 결과 16%이었다. 수소 처리된 다이아몬드 기판를 부분적으로 아민기 처리한 다이아몬드 기판은 p 형 전도성을 나타내며 표면저항 값은 전면이 수소 처리된 다이아몬드 기판 대비 아민기 비율과 비례하여 증가한다[12].
- 음 전압 인가 시 이온 용액에 직접 노출된 다이아몬드 게이트 채널 표면은 버퍼 용액내 특정 이온들과 산화/환원 반응을 일으킬 수 있으며 게이트 채널 부위에서 특정 이온과의 산화/환원 반응은 게이트 채널의 표면 상태를 변화시켜 VGS 크기 변화를 발생시킬 수 있다. 따라서 버퍼 용액속에서 음 전압 인가에 따른 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 표면의 신뢰성 및 타게트 cDNA와 1MM-DNA의 감도차 증가를 확인하였다.
- 유전자 변형에 의한 여러 질병들을 조기에 진단하기 위해 SNPs 검출을 통한 진단 방법은 매우 효율적이며 빠른 진단이 가능하다. 따라서 SNPs를 정확하게 검출하기 위한 많은 방법들이 제시되어 왔으며 현재에도 이와 관련된 많은 연구가 진행되고 있다[3～5].
- 음 전압 인가에 따른 타게트 cDNA와 1MM-DNA의ΔVGS 차는 그림 3(b)에서와 같이 음 전압을 인가했을 때 8.7 ㎷로 음 전압을 인가하지 않았을 경우(1.7 ㎷) 대비 약 5배 증가하였으며 전기적 바이어스를 인가하는 방법이 인가하지 않은 방법과 비교하여 1MM-DNA를 고감도로 검출하였다.
- 그림 2에서 보는 것과 같이 아민기 처리된 패턴 내부에서는 프로브 DNA 고정 및 타게트 cDNA의 hybridization이 진행되어 형광현미경을 통해 형광 패턴을 관측할 수 있었으며 불소 처리된 패턴 외부에서는 형광을 관측할 수 없었다. 이를 통해 본 연구에서 사용하는 DNA 고정 및 hybridization 방법이 다결정 다이아몬드 기판에서 문제가 없음을 확인하였다. 이와 동일한 공정으로 다이아몬드 SGFETs의 게이트 채널 표면에서 프로브 DNA 고정 및 타게트 DNA hybridization을 진행하였다.
- 타게트 DNA hybridization 검출 감도인 ΔVGS는 음 전압을 인가함으로써 cDNA 경우 29.6 mV에서 22.5 mV로 감소 하였고, 1MM-DNA는 27.9 mV에서 13.8 mV로 감소하였다.
- 타게트 DNA hybridization공정에서 드레인 전극에 음 전압을 인가함으로써 전기적 반발력 영향이 상대적으로 cDNA대비 1MM-DNA에서 증가하고 그에 따라 1MM-DNA의 hybridization이 감소하여 cDNA와의 ΔVGS 차가 증가하는 것으로 사료된다.
후속연구
- 3V)을 인가함으로써 상보적 타게트 DNA(cDNA) 및 1-염기 차(1MM-DNA) 타게트 DNA의 hybridization 효율성 제어를 통해 타게트 cDNA와 1MM-DNA를 기존 검출 방식 대비 고감도로 검출하였다. 본 방법은 전해질 용액에서 넓은 전위창을 갖고 있으며 물리적-화학적 안정성이 우수한 다이아몬드 기판에서 가능하며 이러한 전기적 바이어스를 이용한 방법은 정성적 및 정량적 제어가 가능하여 효율적으로 다양한 SNPs 검출에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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