[논문]삼릉(三稜) 추출물의 간세포 보호 및 미토콘드리아 보호 효과

서혜림; 이주희; 장미희; 권영원; 조일제; 김광중; 박숙자; 김상찬; 김영우; 변성희

doi:10.14374/hfs.2015.23.2.189

삼릉(三稜) 추출물의 간세포 보호 및 미토콘드리아 보호 효과
Mitochondria protection of Sparganii Rhizoma against oxidative stress in heptocytes 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.23 no.2, 2015년, pp.189 - 198

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : Sparganii Rhizoma is frequently used in traditional herbal medicine for treatment of blood stasis, amenorrhea and functional dyspepsia and has been reported to exhibit anti-oxidant, anti-proliferation and anti-angiogenesis peoperties. In this study, we investigated the cytoprotective effect and underlying mechanism of Sparganii Rhizoma water extract (SRE) against oxidative stress-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis in hepatocyte. Methods : To determine the effects of SRE on oxidative stress, we induced synergistic cytotoxicity by co-treatment of arachidonic acid (AA) and iron in the HepG2 cell, a human derived hepatocyte cell line. Results : Treatment of SRE increased relative cell viability and altered the expression levels of apoptosis-related proteins such as Bcl-xL, Bcl-2 and procaspase-3. And SRE also inhibited the mitochondrial dysfunction and excessive reactive oxygen species production induced by AA+iron. In addition, SRE activated of AMP-activated protein kinase (AMPK), a potential target for cytoprotection, by increasing the phosphorylation of AMPKα at Thr-172. Morever, SRE increased phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase, a direct downstream target of AMPK. Conclusion : These results indicated that SRE has the ability to protect against oxidative stress-induced hepatocyte damage, which may be mediated with AMPK pathway.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 아직까지 삼릉의 항산화효과 및 간세포 보호 효과에 대한 연구는 되어있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 인간 간암 세포주 HepG2 cell을 이용하여 삼릉 물 추출물이 AA와 철에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대해 미토콘드리아 보호효과가 있는지 그에 따른 간세포 apoptosis 저해효과를 가지는지 그 작용기전을 밝히고자 하였다.
최근에는 삼릉의 진통 및 항혈전 작용32), 항종양 효능33) 등이 보고된 바 있다. 본 연구에서는 인간 간암 세포주 HepG2 cell을 이용하여 삼릉 물 추출물이 인위적으로 유도된 산화적 스트레스 in vitro 모델에서 간세포 보호 효능을 평가하고, 그 작용기전에 대해 연구하였다.

제안 방법

MTT assay로 300 μg/ml 농도까지 세포독성을 분석한 결과 독성은 나타나지 않았다(Data not shown). 그러므로 본 실험에서는 SRE 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml의 농도로 MTT assay를 진행하였다. 그 결과, AA+iron에 의해 감소한 세포 생존율은 SRE 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 30-300 μg/ml의 농도에서 가장 효과적인 세포 보호능을 나타내었다 (Fig.
AA+iron에 의한 산화적 스트레스는 미토콘드리아 막전위를 파괴하여 미토콘드리아 막투과성 (mitochondrial membrane permeability, MMP)을 증가 시키고, apoptosis를 유도한다. 따라서 SRE가 AA+iron에 의한 apoptosis와 mitochondrial dysfunction을 억제할 수 있는지 알아보기 위해 Rhodamine 123 (Rh123)으로 세포를 염색하여 flow cytometric analysis를 통해 MMP를 측정하였다. 미토콘드리아 막전위에 의해 막에 부착되는 형광염료인 Rh123은 MMP를 측정하는 표지물질이다.
Arachidonic acid (AA) 또한 철의 촉매 하에 미토콘드리아 내의 superoxide 생성을 증가시키며 결과적으로 ROS 또한 증가시켜, 산화적 스트레스와 세포 손상을 더욱 촉진되게 한다29). 따라서 본 연구에서는 산화적 스트레스로 인한 apoptosis를 유도하는 약물로써 철과 AA의 병용처치 모델을 이용하였다.
활성화된 AMPK는 fatty acid synthase, pyruvate kinase 그리고 acetyl-CoA carboxylase C (ACC)와 같은 지질합성에 관계된 유전자 발현을 억제시킨다18,19). 본 연구에서는 SRE의 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포 보호능 작용 기전을 알아보기 위한 실험으로 immunoblot analysis를 수행하였다. SRE를 일정한 시간에 따라 처리한 결과 AMPK 활성화뿐만 아니라 AMPK에 의해 조절되는 ACC의 인산화가 증가하는 것을 확인하였다.

대상 데이터

삼릉은 대원약업사(Daegu, Korea)에서 구입하여, 200 g을 물 1.5 L에 넣고 3시간 동안 가열하여, 열수 추출한 후 추출물을 거즈로 1차 여과하고, 300 mm filter paper (Toyo Roshi Kaisha Ltd, Tokyo, Japan)로 여과하였다. 이 여과액을 rotary evaporator로 감압농축한 후, ultra-Low temperature freezer에 12시간동안 넣어 동결시켰다.

이론/모형

SRE의 ROS 소거활성을 측정하기 위하여 HepG2 cell을 이용하여 DCFH-DA assay를 실시하였다. HepG2 cell을 48 well plate에 5×103 cells/well로 분주하여 배양하였다.
AA처리는 HepG2 cell에서 산화스트레스와 apoptosis를 유발하고, iron처리는 AA로 유도된 독성을 증가시킨다. 따라서 본 실험에서는 HepG2 cell에서 SRE의 AA+iron으로 유도된 apoptosis 저해능을 관찰하기 위하여 MTT assay를 진행하였다. MTT assay로 300 μg/ml 농도까지 세포독성을 분석한 결과 독성은 나타나지 않았다(Data not shown).
먼저 AA와 철의 촉매 하에 유도된 산화적 스트레스에 대한 SRE의 세포 보호효과를 MTT assay를 통해 확인하였다. 그 결과 SRE는 HepG2 cell의 생존율을 통계적으로 유의하게 증가시켰고, 30-300 μg/ml에서 높은 세포생존율을 나타내었다.

성능/효과

본 연구에서는 SRE의 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 세포 보호능 작용 기전을 알아보기 위한 실험으로 immunoblot analysis를 수행하였다. SRE를 일정한 시간에 따라 처리한 결과 AMPK 활성화뿐만 아니라 AMPK에 의해 조절되는 ACC의 인산화가 증가하는 것을 확인하였다.
또한 apoptosis 방어인자 중 하나인 Bcl-xL은 미토콘드리아 외막을 보전하는 인자 중 하나이다40). 따라서, 본 연구에서는 procaspase-3 와 Bcl-2, Bcl-xL과 같은 apoptosis 관련 표지 단백질의 발현을 immunoblot analysis를 통해 관찰하였고, SRE 처치가 AA+iron으로 유도된 apoptosis 표지 단백질들의 발현 증가를 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.
또한 앞서 설명한 바와 같이 AA에 의해 생성된 ROS는 철과 반응하여 산화적 스트레스 및 세포 손상을 증폭시킨다. 본 연구에서 SRE는 DCFH-DA 염색으로 ROS 생산 범위를 측정한 결과 AA+iron 처치로 인해 증가한 H2O2 생성에 대해 소거효과를 보여 주었다.
Mitochondrial permeability transition (MPT)는 과도한 칼슘 유입으로 미토콘드리아 내막의 용질투과도가 급격히 증가하는 것을 말하며, 미토콘드리아에서 생성된 ROS는 막 단백질 thiol을 산화시켜 mPTP의 개방을 일으키고42), 이로 인해 미토콘드리아의 산화적 스트레스 및 세포 독성을 유발한다43,44). 본 연구에서 flow cytometry를 통해 MMP의 변화를 측정한 결과 RN1 fraction 분석을 통해 미토콘드리아 손상과 기능장애에 대한 SRE의 미토콘드리아 보호효과를 확인하였다. 즉, SRE는 미토콘드리아 막전위를 유지함으로써 세포소기관을 보호하였다.
위의 결과를 종합하여, 본 연구에서는 SRE가 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스 및 미토콘드리아 기능장애로부터 세포 보호 효과를 가지며, 이는 AMPK pathway 활성화를 통해 매개된다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 SRE의 세포 보호 효과에 대한 분자 생물학적인 정확한 작용기전을 규명하기 위해서는 후속 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
본 연구에서 flow cytometry를 통해 MMP의 변화를 측정한 결과 RN1 fraction 분석을 통해 미토콘드리아 손상과 기능장애에 대한 SRE의 미토콘드리아 보호효과를 확인하였다. 즉, SRE는 미토콘드리아 막전위를 유지함으로써 세포소기관을 보호하였다.

후속연구

위의 결과를 종합하여, 본 연구에서는 SRE가 AA+iron에 의해 유도된 산화적 스트레스 및 미토콘드리아 기능장애로부터 세포 보호 효과를 가지며, 이는 AMPK pathway 활성화를 통해 매개된다는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 SRE의 세포 보호 효과에 대한 분자 생물학적인 정확한 작용기전을 규명하기 위해서는 후속 연구가 필요할 것으로 여겨진다.

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