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문제 정의
- B 림프구를 LPS로 자극한 경우에 TGF-γ와 IL-10가 역시 분비된다. 따라서 LPS에 의해 자극된 B 림프구에 의해 억제되는 IL-12의 분비가 TGF-γ나 IL-10에 의한 것인지를 알아보기 위해서, TGF-γ와 IL-10에 대한 기능 억제항체를 이용하여 IL-12 생성 억제가 사라지는지를 확인하였다. Fig.
- 본 연구는 LPS에 의해 자극된 B 림프구가 분비한 물질이 수지상세포의 IL-12 분비를 억제하여 Th1 림프구의 분화를 억제함을 보여준다. 이는 고전적으로 알려진 T 림프구에 의한 B 림프구의 활성조절뿐만 아니라 B 림프구에 의한 T 림프구의 분화 조절도 존재함을 보여준다.
- 본 연구는 고전적인 T 림프구에 의한 B 림프구 분화 조절이 아닌 B 림프구에 의한 Th1 림프구 분화가 조절된다는 기전을 보여준다. LPS에 의해 자극된 B 림프구가 분비하는 물질(BDSF)에 의해 수지상세포의 IL-12의 발현이 억제되어 Th1 림프구의 분화를 억제하는 기전이 존재한다.
제안 방법
- 7은 RPMI1640 (10%의 FBS와 1%의 penicillin 와 sterptomycin 포함)으로 배양하였다. Apoptotic celle 마우스의 thymus에서 thymocyte를 분리한 후 500 nM dexameth- asone을 6시간 처리하여 apoptosis를 유도한 후 사용하였다. 사용한 C57BL/3 마우스는 경북대학교 동물실험윤리위원회 규정에 따라 허가받은 시설에서 실험을 하였다 (승인번호 2014-0121-1).
- B 림프구 유래 세포배양액을 이용하여 IL-12 발현 억제가 B 림프구 자체가 아닌 BDSF에 의한 것임을 확인하기 위하여, B 림프구 또는 LPS를 처리한 B 림프구의 배양액으로 pro- moter assay를 하였다. 또한 IL-12는 p35와 p45의 hetero- dimeric dimer로 이루어진 cytokine이므로[6, 7, 9, 21, 22] BDSF에 의한 IL-12 발현 억제가 p40 promoter의 조절에 의해서도 일어나는지를 보기 위하여 p40 promoter activity도 측정하였다.
- B 림프구에 의한 수지상세포 기능 조절을 확인하기 위하여 B 림프구가 수지상세포의 성숙에 미치는 영향을 수지상세포 표현의 마커를 이용하여 확인하였다. Fig.
- B 림프구에서 분비되는 물질에 의한 IL-12의 발현 감소가 transcription 조절에 의한 것인지를 확인하기 위해 luciferase assay를 시행하였다. Apoptotic cell (AC)에 의해 IL-12p35의 발현이 감소됨이 알려져 있기에 [11] AC를 실험에 대한 대조군으로 사용하였다.
- 마우스골수 조혈모세포를 분리하여 GM-CSF와 IL-4를 7일간 처리하여 수지상세포로 분화시킨 후 LPS를 처리하면 IL-12와 IL-10같은 cytokine이 증가한다[2]. B 세포가 수지상세포의 IL-12 분 비에 미치는 영향을 알아보기 위해 비장에서 분리한 B 림프구(Fig. 1A) 또는 LPS에 의해 자극된 B 림프구(Fig.1B)를 함께 배양한 후, IL-12의 발현을 ELISA로 측정하였다. IL-12는 p35와 p40의 heterodimeric dimer로 이루어진 cyto- kine이므로[6, 7, 9, 21, 22] IL-12p40와 IL-12p70의 양을 각각 측정하였다.
- 특히 수지상세포에서 분비하는 IL-12는 Th1림프구의 분화를 촉진하여 B 림프구의 활성에 영향을 준다. BDSF에 의한 수지상세포의 IL-12 발현 억제가 Th1림프구의 분화를 조절하는지를 확인하기 위해 골수 유래 수지상세포를 LPS로 자극하고 BDSF로 IL-12의 발현을 억제시킨 다음, 마우스 비장에서 분리한 naïve CD4+ T 림프구를 함께 배양한 다음 IFN-γ의 분비를 측정하였다. naïve CD4+ T 림프구가 Th1 림프구로 분화하고 활성화되면 IFN-γ의 분비가 증가한다[21].
- 1B)를 함께 배양한 후, IL-12의 발현을 ELISA로 측정하였다. IL-12는 p35와 p40의 heterodimeric dimer로 이루어진 cyto- kine이므로[6, 7, 9, 21, 22] IL-12p40와 IL-12p70의 양을 각각 측정하였다. B 림프구와 수지상세포의 직접적인 interaction이 IL-12의 분비에 중요하게 작용하는지 B 림프구에서 분비되는 soluble factor가 중요한지를 확인하기 위하여 transwell sys- tem을 이용하였다.
- Human IL-12p35 promoter (-1082/+61) 또는 IL-12p40 promoter (-3300/+10)에 firefly luciferase reporter gene이 cloning 된 construct는 Weil Cornell Medical School의 Xiaojing Ma에게 받아서 사용하였다 [11]. 각각의 promoter-re- porter construct를 RAW264.7세포에 electroporator (Bio-Rad)를 이용하여 주입하고, IFN-γ/LPS, 그리고 apoptotic cells, 그리고 B 림프구-세포배양액을 6시간 처리한 후, luciferase ac- tivity를 cell lysate에서 측정하였다. 측정은 luciferase assay kit (promega)를 이용하여 제조자 프로토콜에 따라 하였다.
- 골수에서 분리하여 분화시킨 1×106개의 수지상세포에 LPS 또는 B 림프구 세포배양액을 24시간 처리한 후 CD11c, MHC class Ⅱ, CD86의 발현을 측정하였다. 수지상세포는 PBS로 세척한 후 0.
- B 림프구 유래 세포배양액을 이용하여 IL-12 발현 억제가 B 림프구 자체가 아닌 BDSF에 의한 것임을 확인하기 위하여, B 림프구 또는 LPS를 처리한 B 림프구의 배양액으로 pro- moter assay를 하였다. 또한 IL-12는 p35와 p45의 hetero- dimeric dimer로 이루어진 cytokine이므로[6, 7, 9, 21, 22] BDSF에 의한 IL-12 발현 억제가 p40 promoter의 조절에 의해서도 일어나는지를 보기 위하여 p40 promoter activity도 측정하였다. Fig.
- BL/6 마우스의 비장에서 분리하여 사용하였다. 비장에서 CD19 bead (Miltenyl Biotec)를 이용하여 B 림프구를 제조사의 프로토콜에 따라 먼저 분리한 다음, B 림프구가 제거된 비장세포를 이용 naïve CD4+ T 림프구 분리 kit (Miltenyl Biotec)를 이용하여 역시 제조사의 프로토콜에 따라 T 림프구를 분리하였다. B 림프구는 15%의 FBS 와 1%의 penicillin 와 sterptomycin이 포함된 RPMI1640 me- dia를 사용하여 배양하였다.
- 세포 성분을 제거한 세포배양액에서 IL-12p40, IL-12p35, IFN-γ cytokine 은 R&D bioscience에서 제공되는 kit를 이용하여 제조사 프로토콜에 따라 측정하였다.
- 개의 수지상세포에 LPS 또는 B 림프구 세포배양액을 24시간 처리한 후 CD11c, MHC class Ⅱ, CD86의 발현을 측정하였다. 수지상세포는 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin/EDTA를 처리하여 세포를 수집한 다음 FITC로 표지된 각각의 항체(BD biosciences, NJ)와 ice에서 30분간 반응시킨 다음 PBS로 두 번 세척하고 flow cytometry (FACS Calibur; BD biosciences, NJ)를 이용하여 항원을 발현하고 있는 세포의 비율을 측정하여 나타내었다.
- Naïve CD4+ T 림프구는 10% FBS와 1%의 penicillin 와 sterptomycin이 포함된 RPMI1640 media에 IL-2 (10 ng/ml)을 첨가하여 배양하였다. 수지상세포는 마우스의 골수에서 조혈모세포를 분리하여, DMEM media (10%의 FBS와 1%의 penicillin 와 sterptomycin 포함)에서 배양하면서, GM-CSF (250 ng/ml)와 IL-4 (100 ng/ml)를 7일간 처리하여 수지상세포로 분화시켜 사용하였다. luciferase as- say에 이용한 세포는 마우스 대식 세포주인 RAW264.
- 7세포에 electroporator (Bio-Rad)를 이용하여 주입하고, IFN-γ/LPS, 그리고 apoptotic cells, 그리고 B 림프구-세포배양액을 6시간 처리한 후, luciferase ac- tivity를 cell lysate에서 측정하였다. 측정은 luciferase assay kit (promega)를 이용하여 제조자 프로토콜에 따라 하였다. F
대상 데이터
- B 림프구에서 분비되는 물질에 의한 IL-12의 발현 감소가 transcription 조절에 의한 것인지를 확인하기 위해 luciferase assay를 시행하였다. Apoptotic cell (AC)에 의해 IL-12p35의 발현이 감소됨이 알려져 있기에 [11] AC를 실험에 대한 대조군으로 사용하였다. Fig.
- B 림프구와 T 림프구는 C57BL/6 마우스의 비장에서 분리하여 사용하였다. 비장에서 CD19 bead (Miltenyl Biotec)를 이용하여 B 림프구를 제조사의 프로토콜에 따라 먼저 분리한 다음, B 림프구가 제거된 비장세포를 이용 naïve CD4+ T 림프구 분리 kit (Miltenyl Biotec)를 이용하여 역시 제조사의 프로토콜에 따라 T 림프구를 분리하였다.
- Human IL-12p35 promoter (-1082/+61) 또는 IL-12p40 promoter (-3300/+10)에 firefly luciferase reporter gene이 cloning 된 construct는 Weil Cornell Medical School의 Xiaojing Ma에게 받아서 사용하였다 [11]. 각각의 promoter-re- porter construct를 RAW264.
- 7이다. RAW264.7은 RPMI1640 (10%의 FBS와 1%의 penicillin 와 sterptomycin 포함)으로 배양하였다. Apoptotic celle 마우스의 thymus에서 thymocyte를 분리한 후 500 nM dexameth- asone을 6시간 처리하여 apoptosis를 유도한 후 사용하였다.
- 수지상세포는 마우스의 골수에서 조혈모세포를 분리하여, DMEM media (10%의 FBS와 1%의 penicillin 와 sterptomycin 포함)에서 배양하면서, GM-CSF (250 ng/ml)와 IL-4 (100 ng/ml)를 7일간 처리하여 수지상세포로 분화시켜 사용하였다. luciferase as- say에 이용한 세포는 마우스 대식 세포주인 RAW264.7이다. RAW264.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 시행하였으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 실험 결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조군과 비교하여 student’s t-test에 의해 판정하였으며 p값이 0.05 미만일 때 유의성이 있다고 판단하였다.
- 모든 실험은 3회 반복 시행하였으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 실험 결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조군과 비교하여 student’s t-test에 의해 판정하였으며 p값이 0.
이론/모형
- IL-12는 p35와 p40의 heterodimeric dimer로 이루어진 cyto- kine이므로[6, 7, 9, 21, 22] IL-12p40와 IL-12p70의 양을 각각 측정하였다. B 림프구와 수지상세포의 직접적인 interaction이 IL-12의 분비에 중요하게 작용하는지 B 림프구에서 분비되는 soluble factor가 중요한지를 확인하기 위하여 transwell sys- tem을 이용하였다. Fig.
성능/효과
- 1B에서 보듯이 LPS에의해 활성화된 B림프구와 수지상세포가 직접적인 interaction을 하는 경우(transwell로 분리하지 않은 경우)에서는 억제 효과가 보이지 않는다. 이들 실험 결과로 LPS에 의해 활성화된 B 림프구에서 수지상세포의 IL-12를 감소시키는 soluble한 물질이 분비됨을 다시 한 번 확인할 수 있고 활성화된 B림프구 표면에 수지상세포에 직접 작용하여 그러한 억제 신호를 줄이는 반대신호 가 존재한다고 생각할 수 있다.
- 그리고p40 promoter역시 정도는 약하지만 p35 promoter의 조절과 비슷한 양상을 보인다. 이에 우리는 apoptotic cell이나 LPS로 자극된 B 림프구 유래 세포배양액에 대식세포나 수지상세포에서 분비되는 IL-12의 발현을 억제하는 물질(BDSF)이 존재함을 확인할 수 있다.
후속연구
- 이러한 기전을 이용하면 염증성 질환에 대한 치료가 가능할 것으로 생각된다. 따라서 염증성 질환에 대한 치료제로 사용할 수 있는 물질 개발을 위해 BDSF가 어떤 물질인지를 규명해내는 후속 연구가 필요할 것이다.
- 이는 septic shock 같은 과도한 면역반응이 인체질환을 유발하지 않도록 neg-ative regulation 기전이 존재함을 보여준다. 이러한 기전을 이용하면 염증성 질환에 대한 치료가 가능할 것으로 생각된다. 따라서 염증성 질환에 대한 치료제로 사용할 수 있는 물질 개발을 위해 BDSF가 어떤 물질인지를 규명해내는 후속 연구가 필요할 것이다.
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