[논문]고온성 세균 Caldicellulosiruptor bescii를 이용한 식물성 바이오매스의 분해와 바이오에탄올의 생산

이한승

doi:10.5352/jls.2015.25.12.1450

고온성 세균 Caldicellulosiruptor bescii를 이용한 식물성 바이오매스의 분해와 바이오에탄올의 생산
Plant Biomass Degradation and Bioethanol Production Using Hyperthermophilic Bacterium Caldicellulosiruptor bescii 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.25 no.12 = no.188, 2015년, pp.1450 - 1457

초록
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화석 연료의 고갈과 환경 문제를 극복하기 위하여 식물성 바이오매스를 이용한 바이오연료의 생산이 큰 주목을 받고 있는 가운데 화학적 전처리를 하지 않은 바이오매스를 직접 분해할 수 있는 그램 양성 초호열성 세균 Caldicellulosiruptor bescii에 대한 관심이 높아지고 있다. C. bescii는 식물 세포벽을 구성하는 셀룰로스, 헤미셀룰로스 등의 분해 뿐만 아니라 세포벽을 연결시켜주는 pectin도 효율적으로 분해할 수 있는데 최근 C. bescii의 genetic tool이 개발되면서 바이오매스 분해에 관여하는 효소의 특성 규명과 아울러 대사공학적 방법으로 바이오에탄올을 생산하는 통합바이오공정(consolidated bioprocessing; CBP)의 개발이 가능케 되었다. 본 총설에서는 초고온성 세균인 C. bescii를 이용한 식물성 바이오매스의 분해와 바이오에탄올의 생산에 대한 최신 연구결과를 소개하고 향후 전망에 대해 논하고자 한다.

Abstract ▼ AI-Helper

To overcome the depletion of fossil fuels and environmental problems in future, the research and production of biofuels have attracted attention largely. Thermophilic microorganisms produce effective and robust enzymes which can hydrolyze plant biomass and survive under harsh bioprocessing conditions. Caldicellulosiruptor bescii, which can degrade unpretreated plants and grow on them, is the one of the best candidates for consolidated bioprocessing (CBP). C. bescii can hydrolyze pectin efficiently as well as the major plant cell wall components, cellulose and hemicelluloses. Many glycosyl hydrolases and carbohydrate lyases with multidomain structure play an important role in plant biomass decomposition. Recently genetic tools for metabolic engineering of C. bescii have developed and bioethanol production from unpretreated biomass is achieved in C. bescii. Here, we review the recent studies for biomass degradation by C. bescii and bioethanol production in C. bescii in order to provide information about metabolic engineering of themophilic bacteria and biofuel development.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

bescii의 유전공학적 기법들이 개발됨에 따라 이 세 단계를 통합할 수 있는 통합바이오공정 (consolidated bioprocessing; CBP)이 큰 주목을 받고 있다[12]. 따라서 본 총설에서는 초고온성 세균인 C. bescii를 이용한 식물성 바이오매스의 분해와 바이오에탄올의 생산에 대한 최신연구 결과를 소개하고 향후 전망에 대해 논해보고자 한다.

제안 방법

대장균와 C. bescii에서 복제 가능한 셔틀 벡터를 만들기 위해 C. bescii가 갖고 있는 두 개의 플라스미드[18] 중 크기가 작고 replication origin을 갖고 있는 pBAS2에 uracil auxo- troph complementation 용 pyrF 유전자를 삽입하였고 대장균의 low copy replication origin PSC₁₀1과 apramycin resistant gene cassette (AprR)를 연결하여 pDCW89를 구축하였다[11]. 유전자의 결실이나 도입을 위해 외래 DNA를 형질전환 시켰을 때 가장 큰 장애물 중 하나는 외래의 DNA가 들어 왔을 때 DNA의 methylation의 차이를 인식해서 균주 내부의 re- striction system에 의해 도입된 DNA를 분해하는 restriction- modification (R-M) system인데 위에서 구축한 pDCW89 셔틀벡터를 전기충격법(electroporation)으로 형질전환 시키면 그 효율이 매우 낮은 단점이 있다.
현재까지 가장 많이 알려졌고 고온성 고균에서 검증된 nutritional selection 방법은 피리미딘 생합성 경로에 관여하는 orotidine 5-phosphate de- carboxylase (pyrF) 결실 균주를 이용하여 uracyl auxotroph로서의 성질과 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 저항성을 동시에 이용하는 선별법이다[38]. 따라서 orotate phosphoribosyl- transferase (pyrE) 또는 pyrF가 결실된 uracil auxotroph를 만들기 위하여 casein과 yeast extract를 뺀 modified DSMZ 516 배지에 temperature shock을 주어 mutation stress를 준 후 uracil이 포함된 minimal 배지에 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 를 농도별로 첨가하여 자라는 콜로니로부터 genomic DNA를 분리하여 pyrE 또는 pyrF가 결손된 균주를 탐색한 결과 pyrB (Cbes1375)의 N-말단부터 pyrF (Cbes1377)의 C-말단까지 결실된 C. bescii JWCB002 (ΔpyrBCF) 균주를 얻었다[13]. 이 후 uracil이 없는 최소배지(low osmolarity defined growth me- dium, LOD) 조성을 확립하였고[21] 좀 더 selection이 용이한 ΔpyrFA 균주인 C.
이렇게 분해된 당류가 젖산 쪽으로 대사되는 것을 막은 후에 바이오에탄올을 생산하기 위하여 몇가지 알코올 대사 효소 유전자를 발현하여 CBP의 가능성을 탐색하였다. 첫번째 방법은 Clostridium thermocellum의 bifunctional acetaldehyde/al- cohol dehydrogenase 유전자(Cthe-adhE2) [36]를 이용하여 acetyl-CoA로부터 직접 ethanol을 생산하는 방법인데(Fig.

대상 데이터

bescii JWCB002 (ΔpyrBCF) 균주를 얻었다[13]. 이 후 uracil이 없는 최소배지(low osmolarity defined growth me- dium, LOD) 조성을 확립하였고[21] 좀 더 selection이 용이한 ΔpyrFA 균주인 C. bescii JWCB005를 확보하여[11] 형질전환 host로 사용하였다.

성능/효과

또한 transcriptomics에서 가장 높은 up-regulation을 보였던 pectin의 영향을 검토하기 위하여 pecABC cluster를 모두 deletion 시켜 바이오매스의 분해 정도를 확인한 결과[15], 화학적 전처리를 하지 않은 poplar와 switchgrass에서는 각각 34%와 27%의 생육이 감소되었고 Arabidopsis에서는 61%나 생육이 감소되었다. 이는 식물성 바이오매스의 이용에 펙틴의 분해가 중요하다는 것을 다시 한 번 보여주는 결과이다.
bescii의 대사공학적 연구가 CBP를 더 높은 효율로 이루기 위해 진행되고 있다. 먼저 가장 중요한 세포외 단백질인 CelA의 중요성을 확인하기 위하여 celA를 deletion 시킨 결과[43], Avicel에서 생육시켰을 경우, 균주의 생육이 80% 가까이 급격하게 감소하는 것을 확인하였고 환원당의 생산도 15-fold 감소하였다. 화적적으로 전처리하지 않은 poplar, switchgrass, Arabidopsis에서는 균주의 생육이 Avicel에 비해 상대적으로 크게 감소하지는 않았는데(30% 내외) 이는 cellulose 이외의 다른 다당류를 분해해서 이용했기 때문으로 생각된다.

후속연구

특히 고발현을 위한 프로모터의 개발과 heterologous expression을 위한 좀 더 고효율 replicating vector의 개발이 필요하다. 또한 uracil auxotroph를 이용한 nutritional selection 방법은 5-FOA를 이용한 counter se- lection이 필요하므로 좀 더 시간과 노력을 단축시킬 수 있는새로운 항생제 선별기법도 필요할 것이다. 하지만 현재까지의 방법으로도 여러 유전자의 deletion과 insertion이 가능하므로 다양한 glycosyl hydrolase의 과발현 및 조절유전자의 조작을 통해 전처리하지 않은 바이오매스를 더 고효율적으로 분해하는 변이주를 개발하려는 시도가 계속될 것이다.
그런데 Basen 등[3]은 초고온성아키아인 Pyrococcus furiosus에 Thermoanaerobacter strain X514 의 adhA를 삽입한 결과 놀랍게도 adhE를 단독으로 또는 함께 삽입했을 때보다 훨씬 더 많은 에탄올 생산이 이루어지는 것을 확인하였다. 이는 P. furiosus의 aldehyde ferredoxin oxi- doreductase (AOR)이 acetate를 acetaldehyde로 전환 시키기 때문인 것으로 밝혀졌는데 AORe 여러 알데하이드에 활성을 보이므로 butyrate를 buthanol로 전환시킬 수도 있어서 에탄올뿐만 아니라 고가의 다른 알코올 생산에도 활용이 가능할 것으로 생각된다. 현재 이 pathway는 P.
bes- cii의 내부에서 스스로 복제가능한 플라스미드 벡터를 개발하였고 CelA를 성공적으로 발현하는데 성공하였다. 이러한 발현 기술은 원하는 효소의 과발현뿐만 아니라 생리적 특성을 밝히는데 앞으로 더욱 큰 도움이 될 전망이다.
또한 uracil auxotroph를 이용한 nutritional selection 방법은 5-FOA를 이용한 counter se- lection이 필요하므로 좀 더 시간과 노력을 단축시킬 수 있는새로운 항생제 선별기법도 필요할 것이다. 하지만 현재까지의 방법으로도 여러 유전자의 deletion과 insertion이 가능하므로 다양한 glycosyl hydrolase의 과발현 및 조절유전자의 조작을 통해 전처리하지 않은 바이오매스를 더 고효율적으로 분해하는 변이주를 개발하려는 시도가 계속될 것이다. 특히 경제성 있는 수준의 CBP를 위해서는 고농도(high load) 바이오매스의 분해가 가능해야 하는데 그러기 위해서는 바이오매스 분해로 발생하는 유독물질의 저감이 필요하며 C.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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