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문제 정의
- 따라서 본 연구는 acacetin을 자궁경부암세포주인 HeLa 세포에 처리하여 세포생존율 및 apoptosis 유도 확인하고 그와 관련된 기전을 조사하였다.
제안 방법
- 19) Mitochondria pathway는 세포 내의 자극으로 미토콘드리아 막의 투과성이 변화되어 세포질내 apoptosis 인자를 방출해 caspase9를 활성화시켜 apoptosis가 시작된다.20) 앞선 실험 결과로부터 acacetin에 의한 apoptosis 유도 효과가 caspase-9의 활성화와 관련있다는 것을 확인했기 때문에 mitochondria pathway에서 나타나는 특징인 미토콘드리아 내부 전위차 손실 정도를 DiOC6를 사용해 알아보았다. DiOC6는 미토콘드리아를 염색하는 시약으로 DiOC6의 형광 감소량을 통해 미토콘드리아 막전위 변화를 알 수 있다.
- Acacetin을 0, 1, 2, 4, 6 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 지난 후 trypsin-EDTA로 cell을 수확하였다.
- Acacetin을 0, 1, 2, 4, 6 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 지난 후 trypsin-EDTA로 cell을 수확하였다. DiOC6를 첨가해 빛을 차단하여 37℃에서 20분간 방치하고 PBS로 세척한 후 flow cytometer로 관찰하였다.
- 생성된 pellet을 1x binding buffer에 풀어주고 annexin V-FITC와 PI 시약으로 염색하였다. FACSCanto II flow cytometer(BD Biosciences, San jose, CA, USA)를 이용하여 apoptosis 발생을 확인하였다.
- HeLa 세포에 acacetin을 처리하였을 때 세포 생존율을 알아보기 위해 MTT assay를 시행하였다. Acacetin의 농도는 0 μg/ml에서 12 μg/ml를 범위로 하여 24시간 동안 처리하였다.
- 1차 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 2차 항체와 반응시켰다. 단백질 발현은 ECL용액을 처리하여 LAS3000(Fuji, Tokyo, Japan)에서 측정하였다.
- 또한 apoptosis의 유도기전에서 caspase 활성화가 중요한 역할을 하는 것인지 알아보기 위하여 broad caspase inhibitor인 z-VAD-fmk를 acacetin 6 μg/ml와 같이 처리한 후 발생한 apoptosis을 확인하였다.
- 미토콘드리아 막 전위의 변화를 조사하기 위하여 DiOC6 염색을 시행하였다. Acacetin을 0, 1, 2, 4, 6 μg/ml의 농도로 처리하여 24시간 지난 후 trypsin-EDTA로 cell을 수확하였다.
- 세포 증식 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 확인하기 위하여 apoptosis V-FITC/PI 이중 염색 후 유세포분석기를 사용하여 apoptosis의 발생 정도를 측정하였다. 실험결과 acacetin 농도가 1~6 μg/ml로 높아짐에 따라 초기 apoptosis의 발생 비율이 15~27%로 유의적로 증가한 것이 관찰되었다(Fig.
- 2). 이후의 실험은 70% 이상의 생존율을 나타내는 농도를 택하여 진행하였다.
대상 데이터
- 세포배양에 사용한 RPMI 1640 배지, Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin 항생제는 WelGENE(Daegu, South Korea)에서 구입하였다. Acacetin, 3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide(MTT)시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, Annexin V-FITC apoptosis detection Kit는 BD Biosciences(San Jose, CA, USA)제품을 사용하였다. Caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, PARP, β-actin antibody는 cell signaling(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, western blotting detection kit(ECL solution)은 Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ, USA)사에서 구입하였다.
- Caspase-9, cleaved caspase-3, cleaved caspase-7, PARP, β-actin antibody는 cell signaling(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, western blotting detection kit(ECL solution)은 Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ, USA)사에서 구입하였다.
- 본 연구에서 사용한 HeLa 세포는 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank)으로부터 분양받았고 10% FBS, 항생제(10,000 units/ml penicillin G sodium, 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 37oC, 5% CO2인 환경에서 배양하였다.
- 세포배양에 사용한 RPMI 1640 배지, Dulbecco’s phosphate buffered saline(DPBS), fetal bovine serum(FBS), trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin 항생제는 WelGENE(Daegu, South Korea)에서 구입하였다.
데이터처리
- 본 연구의 실험 결과는 평균±SD로 표시하였다.
- 본 연구의 실험 결과는 평균±SD로 표시하였다. 통계처리는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하고 사후검정으로 Turkey test를 이용하였다. p-value가 0.
이론/모형
- Cells were treated with indicated concentrations of acacetin for 24 h. Apoptosis was evaluated by annexin V-FITC/PI double staining assay. Representative results are shown in (A).
- 세포생존율은 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HeLa 세포를 96-well plate에 분주하여 안정화시킨 후 조건에 따라 acacetin을 처리하고 24시간 동안 배양하였다.
성능/효과
- 16) PARP의 발현양을western blotting으로 확인한 결과 acacetin을 처리한 경우 대조군에 비해 cleaved PARP(85 kDa)가 뚜렷하게 증가하였다(Fig. 4). 따라서 acacetin이 apoptosis를 일으켜 HeLa 세포의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 acacetin에 의해 HeLa 자궁경부암 세포의 세포생존율이 유의적으로 감소한 것을 확인하고 이는 apoptosis 유도와 관련이 있다는 것을 초기 apoptosis의 발생 증가와 PARP cleavage 발현을 통해 알 수 있었다. Acacetin에 의한 apoptosis 유도 효과는 caspase-9 및 caspase-3, -7을 활성화시킴으로서 일어난 것으로 나타났다. 또한 미토콘드리아 막 전위 변화에 의해 mitochondria pathway가 관여한다는 것이 확인되었다.
- DiOC6는 미토콘드리아를 염색하는 시약으로 DiOC6의 형광 감소량을 통해 미토콘드리아 막전위 변화를 알 수 있다. DiOC6로 염색한 후 유세포분석기로 분석한 결과, acacetin이 농도가 증가함에 따라 DiOC6 형광 정도가 유의적으로 감소함을 관찰할 수 있었다(Fig. 7). 따라서 acacetin에 의한 apoptosis 유도 기전은 mitochondria pathway와 관련이 있다는 것을 알 수 있었다.
- 18) Acacetin에 의한 apoptosis 유도가 caspase 활성화와 관련되어 일어났는지의 여부는 western blotting을 통하여 확인하였다. 그 결과 acacetin의 농도가 커짐에 따라 initiator caspase인 caspase-9이 감소하는 반면, effector caspase인 caspase-3, caspase-7은 증가한 것으로 관찰되었다(Fig. 5).
- 7). 따라서 acacetin에 의한 apoptosis 유도 기전은 mitochondria pathway와 관련이 있다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Shim HY 등의 연구에서 acacetin이 MCF7 유방암세포에서 미토콘드리아를 매개로 caspase의 활성화를 통해 apoptosis를 일으킨다는 결과와 일치하며,21) HeLa 자궁경부암세포에서 acacetin의 apoptosis 유도 효과는 본 연구를 통해 처음으로 확인되었다.
- 4). 따라서 acacetin이 apoptosis를 일으켜 HeLa 세포의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
- Acacetin에 의한 apoptosis 유도 효과는 caspase-9 및 caspase-3, -7을 활성화시킴으로서 일어난 것으로 나타났다. 또한 미토콘드리아 막 전위 변화에 의해 mitochondria pathway가 관여한다는 것이 확인되었다.
- 본 연구에서는 acacetin에 의해 HeLa 자궁경부암 세포의 세포생존율이 유의적으로 감소한 것을 확인하고 이는 apoptosis 유도와 관련이 있다는 것을 초기 apoptosis의 발생 증가와 PARP cleavage 발현을 통해 알 수 있었다. Acacetin에 의한 apoptosis 유도 효과는 caspase-9 및 caspase-3, -7을 활성화시킴으로서 일어난 것으로 나타났다.
- Acacetin의 농도는 0 μg/ml에서 12 μg/ml를 범위로 하여 24시간 동안 처리하였다. 실험 결과 acacetin에 의해 HeLa 세포의 생존율이 억제되었으며, 농도가 증가함에 따라 세포 증식 억제 효과가 더 크게 나타난 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 이후의 실험은 70% 이상의 생존율을 나타내는 농도를 택하여 진행하였다.
- 실험결과 acacetin 농도가 1~6 μg/ml로 높아짐에 따라 초기 apoptosis의 발생 비율이 15~27%로 유의적로 증가한 것이 관찰되었다(Fig. 3).
- 따라서 acacetin에 의한 apoptosis 유도 기전은 mitochondria pathway와 관련이 있다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Shim HY 등의 연구에서 acacetin이 MCF7 유방암세포에서 미토콘드리아를 매개로 caspase의 활성화를 통해 apoptosis를 일으킨다는 결과와 일치하며,21) HeLa 자궁경부암세포에서 acacetin의 apoptosis 유도 효과는 본 연구를 통해 처음으로 확인되었다.
- 6에서 나타낸 바와 같이 초기 apoptosis는 acacetin을 처리하였을 때 26%였으나 z-VAD-fmk에 의해 15%로 유의적인 감소를 보였다. 이를 통해 acacetin에 의한 apoptosis는 caspase 활성화를 통하여 유도된 것임을 확인할 수 있었다.
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