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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 한국전통발효식품인 고추장아찌, 갈치 젓갈에서 분리된 균주들을 이용하여 어류질병세균과 인체 유해 세균에 대한 항균활성의 확인을 통해 세균성 질병에 대한 치료 및 예방의 가능성을 제시하고자 하였다.
제안 방법
- 5 μM primer, 200 μM de- oxynucleoside triphosphate, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 3 μl를 사용하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cy- cle로 수행되었고, 마지막으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다. 증폭된 PCR product는 ethidium bromide가 첨가하여 1% agarose (promegaCo.
- 젓갈에서 분리하였다. 균주 분리를 위해 0.85% 생리식염수에 고추 장아찌와 갈치 젓갈을 각각 1g을 넣어 단계별로희석시키고, Mann, Rogosa and Sharpe Agar (MRSA, Difco., USA)에 각각 100 μl씩 도말하였다. 그리고 30℃에서 48시간 배양시킨 뒤, 배양된 균 중 단일 콜로니를 분리하고 Man Rogosa and Shape Broth (MRSB, Difco.
- 5) 30 μl로 elution 하였다. 그리고 ABI prismTM bigdyeTM terminator cycle sequencing Ready reaction kit V.3.1 (Fluorescent dye terminators meth- od)와 ABI 3730XL capillary DNA sequencer를 사용하여 PCR product의 염기서열을 분석하였다. 다음 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.
- net/)를 이용하여 상동성을 조사하였다. 다음 ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤, MEGA 6.0로 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였다.
- 1 (Fluorescent dye terminators meth- od)와 ABI 3730XL capillary DNA sequencer를 사용하여 PCR product의 염기서열을 분석하였다. 다음 염기서열은 EzTaxone (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)를 이용하여 상동성을 조사하였다. 다음 ClustalX로 multiple alignment를 수행한 뒤, MEGA 6.
- 모든 균주는 Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer, Korea) 를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 각각 27F/1492R universal primer 0.
- 다음 멸균된 8 mm paper disc (ADVANTEC, Japan)에 50 μl씩 분주하여 30℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 병원균들은 MacFarland turbidity 0.4로 조절하고 Muller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에 도말하여 각 배양 온도에 따라 48시간 배양시켜 형성된 억제 환을 측정하였다.
- -70℃에서 보관하여 사용하였다. 유해세균들은 각각 해당 배지에 알맞게 배양하였고, 분리된 균주들은 MRSB에 접종 시켜 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 다 자라난 배양액은 14, 240 ×g로 원심 분리하여 상등액과 균체를 나누어 항균 활성에 사용하였고, 분리된 상등액은 0.
- PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cy- cle로 수행되었고, 마지막으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다. 증폭된 PCR product는 ethidium bromide가 첨가하여 1% agarose (promegaCo., USA) gel에서 전기 영동 하여 확인하였다. 다음 AccuprepTM PCR purification Kit (Bio-neer, Korea)를 사용하여 PCR product에 남은 primers, nu- cleotides, polymeraes, salts를 제거하고 정제시킨 뒤, elu- tionbuffer (10 mM Tris-Cl, pH 8.
- 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 genomic DNA는 각각 27F/1492R universal primer 0.5 μM primer, 200 μM de- oxynucleoside triphosphate, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 3 μl를 사용하여 PCR를 수행하였다. PCR 반응 조건은 Intial denaturation (95℃, 2분), Denaturation (95℃, 30초), Annealing (55℃, 30초), Extension (72℃, 30초)으로 총 30 cy- cle로 수행되었고, 마지막으로 다시 한번 Extension (72℃, 5분) 하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 어류질병세균과 인체유해세균은 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)와 한국 미생물 보존센터 (Korean Culture Center of Microorgan- isms, KCCM)에서 분양 받고(Table 1) stock (25% glycerol) 화시켜 -70℃에서 보관하여 사용하였다. 유해세균들은 각각 해당 배지에 알맞게 배양하였고, 분리된 균주들은 MRSB에 접종 시켜 30℃에서 48시간 동안 배양하였다.
- 본 연구에서 사용된 GKM1~7, JKM1~3 균주들은 16S ribo- somal RNA PCR 증폭을 통해 전체 염기 서열을 얻었다. 그리고 EzTaxone을 이용하여 분석한 결과, JKM-2는 Bacillus sub- tilis 97.
- 실험에 사용된 균주는 한국전통발효식품인 고추 장아찌와 갈치 젓갈에서 분리하였다. 균주 분리를 위해 0.
성능/효과
- mutas) 의항균 활성이 관측 되었고, 그 외 나머지 균주들은 관측되지 않았다(Table 4). 갈치 젓갈에서의 균체 항균 활성 측정 결과, GKM-5는 35 mm(S. parauberis), 28 mm(V. vulnificus), 27 mm(S. mutans)로 높은 항균 활성을 나타냈다. 다음 GKM-8은 32 mm(S.
- 그리고 EzTaxone을 이용하여 분석한 결과, JKM-2는 Bacillus sub- tilis 97.71%, Bacillus tequilensis 97.71%, Brevibacterium hal- otolerans 97.71%, Bacillus subtils 97.63%, Bacillus subtlis 97.63 %, Bacillus mojavensis 97.54%, Bacillus vallismortis 97.46%, Bacillus nanillea97.45%, Bacillus smethylotrophicus 97.37%, Bacillus siamensis 97.37%로 분석되었고, 이에 대한 계통수를 작성 하였다(Fig. 1). 다음 JKM-1은 Pullulanibacillus pueri 99.
- 1). 다음 JKM-1은 Pullulanibacillus pueri 99.89%, JKM-3은 Leuconostoc citreum 97.96%, GKM-1은 Bacillus sonor- ensis 98.19%, GKM-2는 Bacillus subtilis 99.25%, GKM-3은 Pediococcus ethanolidurans 99.13%, GKM-4는 Bacillus subtilis 98.90%, GKM-5는 Leuconostoc mesenteroides 99.67%, GKM-6은 Lactobacillus brevis 99.56%, GKM-7은 Bacillus safensis 98.57% 의 상동성을 보였다. 그리고 JKM-2과 JKM-3은 신종 확인 실험이 수행되어야 할 것으로 사료 된다.
- 또한 2차 대사산물로 알려져 있는 항생제와 달리, 박테리오신은 자신의 유전자로부터 직접 생합성하고[2] 단백질로 구성되어 있어 인체 내 가수분해 효소에 의해 쉽게 분해 되기 때문에 생체 내 무독성이며 잔류성이 적다[21]. 본연구에서 사용된 분리균주들은 어류질병세균 및 인체 유해 세균에서 대부분 상등액에서의 항균 활성이 나타나지 않았으며, 박테리오신이 균체 내 생합성하는 것으로 추측된다. 따라서, 균체 내 물질에 관한 규명 및 추가 연구가 진행되어야 할 것으로 여겨진다.
- 분리균주들의 항균활성 탐색 결과, 고추 장아찌에서 분리된 3종(Table 2)과 갈치 젓갈에서 분리된 7종(Table 3)이 높은 항균 활성을 나타내었다. 특히 JKM-2은 43 mm (S.
- 나타내었다. 특히 JKM-2은 43 mm (S. iniae), 40 mm (S. parauberis), 35 mm (S. mutans) 26.5 mm (V. vuinificus)로 4개의 균주 중 항균 활성이 가장 높았다. JKM-1는 28 mm (V.
후속연구
- 본연구에서 사용된 분리균주들은 어류질병세균 및 인체 유해 세균에서 대부분 상등액에서의 항균 활성이 나타나지 않았으며, 박테리오신이 균체 내 생합성하는 것으로 추측된다. 따라서, 균체 내 물질에 관한 규명 및 추가 연구가 진행되어야 할 것으로 여겨진다.
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