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문제 정의
- 그러나 국내에는 항생제 대체제에 대한 관심과 활용은 증대되고 있으나, 대체 물질에 대한 정보와 연구가 미흡한 실정이다. 따라서 본 실험에서는 천연 항생펩타이드인 꿀벌 봉독 유래의 멜리틴 펩타이드를 생산하는 누에를 개발하기 위하여 형질전환 누에를 이용하여 실험을 진행하였다.
가설 설정
- Fluorescence expression of EGFP in transgenic silkworms. A) Eggs were expressed in the eyes and the abdominal nervous system of seven days old F1 embryo. Arrows point to eyes and nervous system in panel.
- Arrows point to eyes and nervous system in panel. B) Larva was expressed in the eyes of a F1 1th instar larva. C) and D) fluorescent images of pupa and moth.
제안 방법
- G2 세대 형질전환누에를 서로 교배하여 5령 5일까지 사육한 후 형질전환누에에서 생산된 melittin 항균펩타이드에 대한 항균활성을 분석하였다. 분석방법은 방사상 확산분석(RDA, Radial Diffusion Assay)방법을 이용하였고, 그람음성 세균인 E.
- 제한효소 Sau3AI로 절단된 genomic DNA는 T4 DNA ligase를 사용하여 selfligation을 유도하고, 이를 주형으로 하여 5’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3’(25 mer) 와 antisense primer는 5’-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’(25 mer)을 사용하였고, 3’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3’(23 mer)와 antisense primer는 5’-GGGGTCCGTCAAAACAAAACAT C-3’(23 mer)를 사용하여 Inverse PCR를 수행하였다. Inverse PCR 결과로 증폭된 PCR product는 pGEM-T easy 벡터에 클로닝한 다음, 삽입 단편에 대하여 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열에서 전이벡터(piggyBac) 서열을 제외한 염기서열만으로 silkworm genome research program(http://sgp.
- 이들 단편들은 Asc I과 Nhe I으로 제한효소 처리된 piggyBac 전이벡터인 pBac-3xP3-EGFP vector에 클로닝하였고, pG3xP3EGFPBmA3로 명명하였다. Melittin 유전자는 유전자합성(Bioneer Co.)에 의해서 확보하였고, Nhe I/Afl II 제한효소를 사용하여 melittin 유전자를 piggyBac 벡터의 Nhe I/Afl II 위치에 재클로닝하여 형질전환 전이 벡터인 pG3xP3EGFPBmA3Mellittin를 제작하였다.
- 먼저 G2 세대의 5령 5일 유충 중 180마리에서 각각 체액을 채취한 후 전처리 하였다. RDA 분석 결과에서 항균활성이 높은 5마리의 누에와 비교적 항균활성이 있는 5마리 누에를 선발하였고, 사육 후 서로 교배하여 계대사육을 진행하였다(그림 3). 앞의 과정으로 선발된 G3 세대 5령 5일 누에에서 체액을 채취한 후 전처리하여 RDA 검정을 하였다.
- Sense primer는 Asc I 제한효소 인식서열을 포함하여 5’-GGCGCGCCGCGCGTTACCATATATGGTG-3’를 사용하였고 antisense primer는 Nhe I 제한효소가 포함된 5’-GCTAGCCTTGAA TTAGTCTGCAAGAAA -3’를 사용하여 누에 gDNA를 주형으로 PCR을 이용하여 증폭하였고, pGEM-T Easy Vector System (Promega, Madison WI)에 클로닝하였다.
- Peptide가 확산되도록 37 ℃에서 3시간 배양한 후, overlay gel(6% TSB, 1% agarose)을 붓고 37 ℃에서 다시 배양한다. 각각의 peptide의 항균 활성력은 18시간 후부터 나타나는데, 세균이 번식하지 않는 clear zone의 크기로 확인하였다.
- 누에 게놈 내 melitin 유전자 도입 확인 및 염색체 내에 도입 위치를 분석하였다. 분리사육 된 제2세대(G2) 누에 형질전환체 4개 아구의 강건성, 생존율, 우화율, 산란율 등을 고려하여 최종적 2개 아구만을 선정하여 분석하였다.
- 누에에서 melittin 유전자가 발현되는 형질전환 누에를 만들기 위해 누에 액틴3프로모터와 melittin 유전자를 pBac3xP3-EGFP 벡터에 도입하여 제작하였다. 먼저 누에 액틴 3 프로모터를 얻기 위해서, 다음의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 통해 확보하였다.
- 본 실험에서는 누에형질전환 시스템을 이용하여 봉독 유래의 멜리틴 항균펩타이드를 생산하는 형질전환누에를 제작하였다. 누에에서 melittin 항균펩타이드가 발현되는 형질전환누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다.
- 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. 누에의 액틴3 프로모터를 얻기 위해서, 누에 게놈으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였고, melittin 유전자는 누에 액틴 3 프로모터와 SV40poly A사이에 클로닝하였다. 이렇게 제작된 벡터는 pG3xP3- EGFPBmA3Mellittin로 명명하였다(그림 1).
- 누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사하였으며, 그 과정은 다음과 같다. 먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난각에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 microcapillary의 끝을 삽입 후, microinjector의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다. 이때 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10~15 nl가 사용되었고, 난각에 생긴 구멍은 cyanocrylate 접착제를 사용하여 막았다.
- 이후 각 아구별로 선발한 누에 형질전환체는 아구 별로 분리사육하여 번데기를 확보한 다음 번데기를 이용하여 형질전환 유무를 재차 확인하였다. 번데기의 형질전환 유무는 향후 성충의 눈으로 형성될 부분에 표지유전자인 EGFP 발현 유무를 형광현미경으로 검경하였다. 형광현미경 검경에 의해서 형질전환이 확인된 번데기는 성충(누에나방)까지 발생시킨 다음, 같은 아구 내 성충을 sib-mating하여 제 2세대(G2) 잠종을 확보하였다(그림 2).
- 본 실험에서는 누에형질전환 시스템을 이용하여 봉독 유래의 멜리틴 항균펩타이드를 생산하는 형질전환누에를 제작하였다. 누에에서 melittin 항균펩타이드가 발현되는 형질전환누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다.
- 누에 게놈 내 melitin 유전자 도입 확인 및 염색체 내에 도입 위치를 분석하였다. 분리사육 된 제2세대(G2) 누에 형질전환체 4개 아구의 강건성, 생존율, 우화율, 산란율 등을 고려하여 최종적 2개 아구만을 선정하여 분석하였다. 선정된 2개의 형질전환체 아구는 Mel-1과 Mel2로 명명하였다.
- 선정된 2개의 형질전환체 아구는 Mel-1과 Mel2로 명명하였다. 선정된 두 아구 내 누에 개체를 대상으로 melitin 유전자 도입을 확인하기 위하여 Inverse PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환 라인 Mel-1과 Mel-2는 각각 1 copy로 존재하고 있었으며, 형질전환 라인 Mel-1는 전이벡터가 9번 염색체 상에 삽입되어 있었고 형질전환 라인 Mel-2는 전이벡터가 21번 염색체 상에 삽입되어있는 것을 확인할 수 있었다(표 2).
- RDA 분석 결과에서 항균활성이 높은 5마리의 누에와 비교적 항균활성이 있는 5마리 누에를 선발하였고, 사육 후 서로 교배하여 계대사육을 진행하였다(그림 3). 앞의 과정으로 선발된 G3 세대 5령 5일 누에에서 체액을 채취한 후 전처리하여 RDA 검정을 하였다. 대조군으로는 백옥잠 5령 5일 누에의 체액과 시그마에서 구입한 melittin(0.
- 4개 아구 내의 형질전환체 발생개체 수는 각 아구별로 차이가 있었는데 적게는 8개체부터 많게는 40여 개체 이상을 확인할 수 있었다. 이후 각 아구별로 선발한 누에 형질전환체는 아구 별로 분리사육하여 번데기를 확보한 다음 번데기를 이용하여 형질전환 유무를 재차 확인하였다. 번데기의 형질전환 유무는 향후 성충의 눈으로 형성될 부분에 표지유전자인 EGFP 발현 유무를 형광현미경으로 검경하였다.
- 실험에 사용한 누에품종은 농가보급 장려품종인 백옥잠 (잠123 × 잠124)을 사용하였고, 백옥잠 누에알 300개를 대상으로 미세주입법에 의한 형질전환을 유도하였다. 전이벡터 pG3xP3EGFPBmA3melittin와 helper plasmid pHA3PIG를 1:1의 농도 비율로 혼합한 다음, 이를 microinjector를 이용하여 제조한 백옥잠 누에알 300개에 미량주입 하였다(그림 1). 형질전환을 유도한 총 300개의 누에알로부터 131마리의 G0 세대의 부화유충을 확보할 수 있었고, 최종적으로 성충(누에나방) 80마리를 확보하였다.
- 제한효소 Sau3AI로 절단된 genomic DNA는 T4 DNA ligase를 사용하여 selfligation을 유도하고, 이를 주형으로 하여 5’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3’(25 mer) 와 antisense primer는 5’-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’(25 mer)을 사용하였고, 3’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3’(23 mer)와 antisense primer는 5’-GGGGTCCGTCAAAACAAAACAT C-3’(23 mer)를 사용하여 Inverse PCR를 수행하였다.
- 형광현미경을 사용한 형질전환체 선발은 Leica(USA)사의 LEICA MZ16FA 현미경과 Leica(USA)사의 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter GFP 형광필터를 사용하여 세대별, 시기별로 관찰하여 선발하였다.
- 형질전환누에로부터 각각 genomic DNA를 분리한 다음, 제한효소 Sau3AI으로 처리하였다. 제한효소 Sau3AI로 절단된 genomic DNA는 T4 DNA ligase를 사용하여 selfligation을 유도하고, 이를 주형으로 하여 5’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-ATCAGTGACACTTACCGCATTGACA-3’(25 mer) 와 antisense primer는 5’-TGACGAGCTTGTTGGTGAGGATTCT-3’(25 mer)을 사용하였고, 3’ 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5’-TACGCATGATTATCTTTAACGTA-3’(23 mer)와 antisense primer는 5’-GGGGTCCGTCAAAACAAAACAT C-3’(23 mer)를 사용하여 Inverse PCR를 수행하였다.
- 형질전환체 선발은 누에 홑눈 내 표지유전자인 EGFP 발현 유무로 확인하였다.
- Inverse PCR 결과로 증폭된 PCR product는 pGEM-T easy 벡터에 클로닝한 다음, 삽입 단편에 대하여 염기서열을 결정하였다. 확보된 염기서열에서 전이벡터(piggyBac) 서열을 제외한 염기서열만으로 silkworm genome research program(http://sgp.dna.affrc.go.jp/)을 이용하여 누에 염색체 내 삽입 위치를 결정하였다.
대상 데이터
- 완성된 플라스미드는 pGEMTBmA3로 명명하였다. 그리고, pGEMT-BmA3는 Asc I과 Nhe I으로, 제한효소 처리함으로써 단편들을 준비하였다. 이들 단편들은 Asc I과 Nhe I으로 제한효소 처리된 piggyBac 전이벡터인 pBac-3xP3-EGFP vector에 클로닝하였고, pG3xP3EGFPBmA3로 명명하였다.
- 형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 백옥잠(123x124)을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도: 24℃ ~ 27℃, 상대습도: 70% ~ 90%)에 준하여 사육하였다. 누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 체코의 Jindra 박사로부터 pBac-3xP3-EGFP 벡터와 helper 벡터인 pHA3PIG를 분양 받아서 사용하였다.
- 누에 형질전환체 선발 결과, 총 36아구로부터 표지유전자인 EGFP가 누에 배아의 5개의 홑눈(stemmata) 과 신경시스템에서 뚜렷하게 발현되는 4개의 아구를 선발할 수 있었다. 누에형질전환체를 포함하고 있는 4개의 아구는 누에사육용 잠박에 개별로 분리하여 사육하였고, 비형질전환체와 형질전환체가 혼재되어 있으므로 형질전환체 선발을 위하여 1령 2일까지 사육한 후, 전체 사육 누에를 대상으로 형광현미경 검경에 의해서 선발하였다. 형질전환체 선발은 누에 홑눈 내 표지유전자인 EGFP 발현 유무로 확인하였다.
- 대조군으로는 백옥잠 5령 5일 누에의 체액과 시그마에서 구입한 melittin(0.016 mg/ml)을 사용하였다.
- coli(KACC 1039)에 대하여 항균활성을 검정하였다. 먼저 G2 세대의 5령 5일 유충 중 180마리에서 각각 체액을 채취한 후 전처리 하였다. RDA 분석 결과에서 항균활성이 높은 5마리의 누에와 비교적 항균활성이 있는 5마리 누에를 선발하였고, 사육 후 서로 교배하여 계대사육을 진행하였다(그림 3).
- 분리사육 된 제2세대(G2) 누에 형질전환체 4개 아구의 강건성, 생존율, 우화율, 산란율 등을 고려하여 최종적 2개 아구만을 선정하여 분석하였다. 선정된 2개의 형질전환체 아구는 Mel-1과 Mel2로 명명하였다. 선정된 두 아구 내 누에 개체를 대상으로 melitin 유전자 도입을 확인하기 위하여 Inverse PCR을 수행하였다.
- 실험에 사용한 누에품종은 농가보급 장려품종인 백옥잠 (잠123 × 잠124)을 사용하였고, 백옥잠 누에알 300개를 대상으로 미세주입법에 의한 형질전환을 유도하였다.
- 번데기의 형질전환 유무는 향후 성충의 눈으로 형성될 부분에 표지유전자인 EGFP 발현 유무를 형광현미경으로 검경하였다. 형광현미경 검경에 의해서 형질전환이 확인된 번데기는 성충(누에나방)까지 발생시킨 다음, 같은 아구 내 성충을 sib-mating하여 제 2세대(G2) 잠종을 확보하였다(그림 2).
- 형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 백옥잠(123x124)을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도: 24℃ ~ 27℃, 상대습도: 70% ~ 90%)에 준하여 사육하였다. 누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 체코의 Jindra 박사로부터 pBac-3xP3-EGFP 벡터와 helper 벡터인 pHA3PIG를 분양 받아서 사용하였다.
- 형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다. 전이벡터와 helper 벡터의 농도비는 1:1의 비율로 사용하였고, microinjection용 완충용액(5 mM KCl, 0.
- 전이벡터 pG3xP3EGFPBmA3melittin와 helper plasmid pHA3PIG를 1:1의 농도 비율로 혼합한 다음, 이를 microinjector를 이용하여 제조한 백옥잠 누에알 300개에 미량주입 하였다(그림 1). 형질전환을 유도한 총 300개의 누에알로부터 131마리의 G0 세대의 부화유충을 확보할 수 있었고, 최종적으로 성충(누에나방) 80마리를 확보하였다. 확보한 G0 세대의 성충은 상호교배를 통하여 G1 세대의 잠종 36아구를 확보하였다(표 1).
- 누에에서 melittin 항균펩타이드가 발현되는 형질전환누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질전환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP 유전자를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. 누에의 액틴3 프로모터를 얻기 위해서, 누에 게놈으로부터 PCR을 이용하여 증폭하였고, melittin 유전자는 누에 액틴 3 프로모터와 SV40poly A사이에 클로닝하였다.
- 형질전환을 유도한 총 300개의 누에알로부터 131마리의 G0 세대의 부화유충을 확보할 수 있었고, 최종적으로 성충(누에나방) 80마리를 확보하였다. 확보한 G0 세대의 성충은 상호교배를 통하여 G1 세대의 잠종 36아구를 확보하였다(표 1). 누에 형질전환체 선발 결과, 총 36아구로부터 표지유전자인 EGFP가 누에 배아의 5개의 홑눈(stemmata) 과 신경시스템에서 뚜렷하게 발현되는 4개의 아구를 선발할 수 있었다.
데이터처리
- G2 세대 형질전환누에를 서로 교배하여 5령 5일까지 사육한 후 형질전환누에에서 생산된 melittin 항균펩타이드에 대한 항균활성을 분석하였다. 분석방법은 방사상 확산분석(RDA, Radial Diffusion Assay)방법을 이용하였고, 그람음성 세균인 E. coli(KACC 1039)에 대하여 항균활성을 검정하였다. 먼저 G2 세대의 5령 5일 유충 중 180마리에서 각각 체액을 채취한 후 전처리 하였다.
성능/효과
- 형질전환체 선발은 누에 홑눈 내 표지유전자인 EGFP 발현 유무로 확인하였다. 4개 아구 내의 형질전환체 발생개체 수는 각 아구별로 차이가 있었는데 적게는 8개체부터 많게는 40여 개체 이상을 확인할 수 있었다. 이후 각 아구별로 선발한 누에 형질전환체는 아구 별로 분리사육하여 번데기를 확보한 다음 번데기를 이용하여 형질전환 유무를 재차 확인하였다.
- 016 mg/ml)을 사용하였다. 그 결과 melittin 누에 형질전환체에서 채취한 체액의 항균활성이 시그마에서 구입한 melittin과 거의 동일한 활성을 나타내었다(그림 4). 따라서 누에에서 melittin 항균펩타이드를 생산하는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다.
- 선정된 두 아구 내 누에 개체를 대상으로 melitin 유전자 도입을 확인하기 위하여 Inverse PCR을 수행하였다. 그 결과, 형질전환 라인 Mel-1과 Mel-2는 각각 1 copy로 존재하고 있었으며, 형질전환 라인 Mel-1는 전이벡터가 9번 염색체 상에 삽입되어 있었고 형질전환 라인 Mel-2는 전이벡터가 21번 염색체 상에 삽입되어있는 것을 확인할 수 있었다(표 2).
- 확보한 G0 세대의 성충은 상호교배를 통하여 G1 세대의 잠종 36아구를 확보하였다(표 1). 누에 형질전환체 선발 결과, 총 36아구로부터 표지유전자인 EGFP가 누에 배아의 5개의 홑눈(stemmata) 과 신경시스템에서 뚜렷하게 발현되는 4개의 아구를 선발할 수 있었다. 누에형질전환체를 포함하고 있는 4개의 아구는 누에사육용 잠박에 개별로 분리하여 사육하였고, 비형질전환체와 형질전환체가 혼재되어 있으므로 형질전환체 선발을 위하여 1령 2일까지 사육한 후, 전체 사육 누에를 대상으로 형광현미경 검경에 의해서 선발하였다.
- 그 결과 melittin 누에 형질전환체에서 채취한 체액의 항균활성이 시그마에서 구입한 melittin과 거의 동일한 활성을 나타내었다(그림 4). 따라서 누에에서 melittin 항균펩타이드를 생산하는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 누에를 재조합단백질의 대량생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
- 따라서 누에에서 melittin 항균펩타이드를 생산하는 누에형질전환체가 제작되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 누에를 재조합단백질의 대량생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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