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문제 정의
- 본 연구는 Rat 1 세포로부터 단백질들을 얻은 후에, 이들 중에서 인산화되어 있는 펩타이드의 동정 및 인산화 위치를 대량으로 밝혀내는 방법을 확립하는 것을 목표로 한다.
제안 방법
- C4 역상 칼럼(4.6 mm×250 mm)을 이용하였고, 분석 조건은 0.1% triflouroacetic acid(TFA)를 포함하는 0% acetonitrile(ACN)에서 60% ACN까지 80분 동안 분석하였고, 용매는 분당 0.3 ml로 흘려 보냈다.
- Rat 1 세포로부터 확인된 각각의 인산화 단백질을 세포내의 위치와 분자적 기능에 의해 분류하였다. 확인된 인산화 단백질의 분자적 기능은 Gene ontology(GO)에 의해 분석되었다(Fig.
- 하지만 C4로부터 얻은 분획들은 아직 단백질 상태이므로 이들은 트립신을 처리하여 펩타이드화 한 후, 이들을 TiO2로 이용하여 인산화 펩타이드 농축을 진행하였다. TiO2를 통하여 얻어진 인산화 펩타이드들을 각각 nano-LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 분석을 통해 얻어진 데이터들은, 방법에 적은 것처럼 Mascot 소프트웨어를 이용하여 인산화 펩타이드들과 그 인산화 위치를 밝혀내었다.
- 3 ml로 흘려 보냈다. UNICORN control software(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 조정된 결과를 얻었다. UV 흡광도를 기준으로 하여 여러 개의 분획들을 합쳐서 총 9개의 시료를 만들었다.
- UNICORN control software(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 조정된 결과를 얻었다. UV 흡광도를 기준으로 하여 여러 개의 분획들을 합쳐서 총 9개의 시료를 만들었다. 펩타이드분리를 위해, 강 양이온교환수지의 경우 RESOURCE S 칼럼(6.
- 1% TFA 완충액에 녹여 resin과 상온에서 한 시간 정도 결합을 시킨다. 그 다음 10% ACN을 포함한 in 0.1% TFA, 80%ACN, 0.1% TFA로 각각 세척하고 암모니아수를 포함한 20%ACN(pH 10.5), 암모니아수를 포함한 40% ACN(pH 10.5)로 용출한 다음 0.1% formic acid를 첨가하여 산성화시켰다.
- 본 연구에서는 Rat 1 세포로부터 단백질들을 얻은 후, 이들 단백질을 C4 역상 칼럼(reverse phase chromatography) 또는 트립신에 의해 절단된 펩타이드를 양이온 교환(strong cation exchange chromatography, SCX) 칼럼을 이용하여 분리하였다. 그 후, 각 분획을 TiO2를 이용하여 인산화 펩타이드를 분리 농축한 후, 각각을 나노 초고성능 액체 크로마토그래피(Nano-Ultra Performance Liquid Chromatography) 질량분석기(Nano-Electron Spray Ionization Quadruple-Time Of Flight Mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다.
- 기존에 인산화 펩타이드 농축을 위해 먼저 Top Tip TiO2 (Glygen, Columbia, MD. USA)을 20 μl의 3g/l DHB를 포함한80% ACN/0.1% TFA, 암모니아수를 포함한 40% ACN(pH 10.5), 0.1% TFA 완충액으로 각각 씻어준 후 마이크로칼럼에 로딩하고, 절단된 펩타이드를 30 g/l DHB를 포함한 80% ACN, 0.1% TFA 완충액에 녹여 resin과 상온에서 한 시간 정도 결합을 시킨다.
- 대량으로 인산화 위치 규명하기 전에, 표준 인산화 단백질인 α-casein을 이용하여 예비 연구를 진행하였다.
- 다른 한편, nano-C18 칼럼 이전에 C4 칼럼을 이용한 경우, C4 칼럼은 nano-C18 칼럼과 마찬가지로 역상 칼럼으로 그 성질이 거의 유사하다. 따라서, 본 연구에서는 Rat 1 세포로부터 단백질을 얻은 후, 펩타이드가 아닌 단백질(1 mg) 상태에서 먼저 C4 칼럼으로 분리한 후, 위와 같은방법으로 하여 UV 프로파일을 기준으로 양이 적은 분획들은 많이 합치고 양이 많은 분획들은 적게 합쳐서 총 16개의 분획을 만들었다(Fig. 2B). 이후에 이들 분획들을 트립신을 처리하여 펩타이드화 하였다.
- 1 Da으로 설정하고 분석결과는 >95%의 정확도를 가지는 2개 이상의 펩타이드로부터 얻어진 단백질만을 최종 결과로 얻었다. 또한 질량분석기 분석을 통해 단백질을 DAVID 소프트웨어(http://david.abcc.ncifcrf. gov/conversion.jsp)를 이용하여 어떠한 세포내 위치 카테고리 및 생물학적 작용 카테고리에 속하는지 분석하였다.
- 0)를시작으로 NaCl이 1M이 될 때까지 20분 동안 분석하였고, 용매는 분당 1ml로 흘려 보냈다. 마찬가지로 UV 흡광도를 기준으로 하여 여러 개의 분획들을 합쳐서 종 16개의 시료를 만들었다.
- 먼저 nano-C18 칼럼과 성질이 다른 양이온 교환 수지를 이용하여 펩타이드를 분리하는 방법을 이용하였다. 이를 위해 우선 Rat 1 세포로부터 1mg의 단백질을 얻은 후, 이를 트립신을 처리하여 펩타이드화하였다.
- 모든 시료는 C18 나노칼럼(75 μm id, 250 mm length, 1.7 μm particle size, Waters Corporation, Milford, MA)으로 분리하였으며, A 용액(0.1% formic acid 수용액)과 B 용액(0.1% formic acid를 포함한 ACN)의 농도구배에 따라 분리하였다.
- 분석은 nanoUPLC와 연결된 nano-ESI quadrupole TOF 질량분석기를 사용하여 이루어졌다(Q-TOF Premier, Waters). 모든분석은 양이온 모드로 분석하였다. 각각의 이온들은 순차적으로 Z 형태의 이온화 부분을 통해 질량 분석기 내부로 들어간다.
- 본 연구에서는 Rat 1 세포로부터 단백질들을 얻은 후, 이들 단백질을 C4 역상 칼럼(reverse phase chromatography) 또는 트립신에 의해 절단된 펩타이드를 양이온 교환(strong cation exchange chromatography, SCX) 칼럼을 이용하여 분리하였다. 그 후, 각 분획을 TiO2를 이용하여 인산화 펩타이드를 분리 농축한 후, 각각을 나노 초고성능 액체 크로마토그래피(Nano-Ultra Performance Liquid Chromatography) 질량분석기(Nano-Electron Spray Ionization Quadruple-Time Of Flight Mass spectrometry)를 이용하여 분석하였다.
- 분석결과, 총 이온 크로마토그램(total ion count)를 얻었고, 이를 noise peak을 제거하고 실제 count만을 보여주는 BPI(base peak intensity)를 얻었다. 이를 PLGS 2.
- 분석은 nanoUPLC와 연결된 nano-ESI quadrupole TOF 질량분석기를 사용하여 이루어졌다(Q-TOF Premier, Waters). 모든분석은 양이온 모드로 분석하였다.
- 세포내에 존재하는 수많은 인산화 단백질들 및 인산화 위치를 질량분석기를 통해 전체적으로 확인하는 방법을 Rat 1 세포를 이용하여 수행하였다. 이를 위해 두 가지 분리 전략(C4 및 양이온 교환 수지)을 이용한 결과, 단백질 상태에서 C4를 이용해서 분리 후 이를 펩타이드화 한 후, TiO2를 이용하여 농축하는 방법이 더 효과적이었다.
- 양이온 교환수지로부터 얻어진 시료들은 이미 펩타이드 상태로 존재하므로 이를 예비실험에서 진행한 것처럼 TiO2를 이용하여 인산화 펩타이드 농축을 진행하였다. 하지만 C4로부터 얻은 분획들은 아직 단백질 상태이므로 이들은 트립신을 처리하여 펩타이드화 한 후, 이들을 TiO2로 이용하여 인산화 펩타이드 농축을 진행하였다.
- 이들 펩타이드를 FPLC 시스템을 이용하여 양이온 교환수지 칼럼으로 분리하였고 그에 해당하는 UV흡광도 프로파일을 얻었다. 얻어진 UV 프로파일을 기준으로 양이 적은 분획들은 많이 합치고 양이 많은 분획들은 적게 합쳐서 총 9개의 분획을 만들었다(Fig. 2A). 다른 한편, nano-C18 칼럼 이전에 C4 칼럼을 이용한 경우, C4 칼럼은 nano-C18 칼럼과 마찬가지로 역상 칼럼으로 그 성질이 거의 유사하다.
- Ga(III), Fe(III) 등을 이용한 IMAC 방법과 TIO2 방법이 잘 알려져 있고,최근에는 Sequential elution from IMAC(SIMAC)과 칼슘을 이용한 침전 방법10)까지 알려져 있다. 이 중에서 본 연구실에서 잘 정립된 TiO2를 이용하여 인산화 펩타이드를 농축하는 방법을 이용하였다.
- 이를 위해 우선 Rat 1 세포로부터 1mg의 단백질을 얻은 후, 이를 트립신을 처리하여 펩타이드화하였다. 이들 펩타이드를 FPLC 시스템을 이용하여 양이온 교환수지 칼럼으로 분리하였고 그에 해당하는 UV흡광도 프로파일을 얻었다. 얻어진 UV 프로파일을 기준으로 양이 적은 분획들은 많이 합치고 양이 많은 분획들은 적게 합쳐서 총 9개의 분획을 만들었다(Fig.
- 이들을 원심분리(4,000 g, 15 min, 4°C)하여 깨지지 않은 세포들을 제거하고, 상등액을 얻은 후, 이를 스핀 필터(0.22 μm)를 이용하여 나머지 작은 불순물들을 제거하였다.
- 1은 본 연구에서 진행한 전체적인 연구의 흐름도를 보여주고 있다. 질량분석기 분리 전에 분석 시료들을 더 분리하기 위해 2개의 다른 칼럼을 사용하는 두 가지 전략을 이용하였다. 특히, 트립신을 처리하는 단계가 다른 데, 즉, 양이온 교환 수지를 이용할 경우에는 칼럼에 의한 분리 전에 트립신을 처리하고, C4를 이용할 경우에는 분리 후에 트립신을 처리하는 것이 다르다는 것이 본 연구의 중요한 분리 전략이다.
- 질량분석기로 얻은 데이터는 Mascot Distiller(Matrix Science; version 2.3.2, Boston, MA)를 이용하여 피크 리스트(mgf 파일)로 변환하였다. Mgf 파일을 Mascot(Matrix Science; version 2.
- 카제인(casein)을 트립신으로 절단한 뒤에 이들 펩타이드를 건조시킨 후, TiO2 로딩 버퍼(loading buffer)로 녹이고, TiO2 resin과 반응시킨 후에 인산화되지 않은 펩타이드를 제거하고, 인산화 펩타이드만을 용출한 후, 이를 질량분석기를 이용하여 분석하였다.
- 펩타이드분리를 위해, 강 양이온교환수지의 경우 RESOURCE S 칼럼(6.4 mm×30 mm)를 이용하였고, 분석 조건은 인산완충액(pH 3.0)를시작으로 NaCl이 1M이 될 때까지 20분 동안 분석하였고, 용매는 분당 1ml로 흘려 보냈다.
대상 데이터
- 사극자에는 직류전하와 라디오 전자기파가 동시에 흐르게 되는데 양전하를 띈 펩타이드 이온들은 사극자 내의 전자기장 내에서 회전하며 이동하는데 이를 바탕으로 각 이온을 정렬하여 선구 이온의 m/z를 얻을 수 있다.데이터는 충돌관(collision cell) 에서 낮은 에너지에서 높은 에너지로 주기적으로 충돌 에너지를 변환시킬 때 사극자에서 모든 이온을 방출하게 되는 MSE(Expression) mode로 받아졌다. 1초 간격으로 스캔하여 MS spectra는 m/z 50에서 m/z 1990까지 얻었다.
- 1, Boston, MA) 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였다.이때 rat 단백질 분석을 위해 IPI rat 데이터베이스(version 3.70; 39,579 sequences; 20,816,731 residues)를 사용하였다. 단백질 동정을 위한 파라미터로는 fixed modification에 carbarmidomethyl C, variable modification 에 oxidation M을 선택하였고 트립신missed cleavage는 2개, 이온 허용 한계는 0.
데이터처리
- TiO2를 통하여 얻어진 인산화 펩타이드들을 각각 nano-LC-MS/MS를 이용하여 분석하였다. 분석을 통해 얻어진 데이터들은, 방법에 적은 것처럼 Mascot 소프트웨어를 이용하여 인산화 펩타이드들과 그 인산화 위치를 밝혀내었다.
이론/모형
- 2, Boston, MA)를 이용하여 피크 리스트(mgf 파일)로 변환하였다. Mgf 파일을 Mascot(Matrix Science; version 2.2.1, Boston, MA) 프로그램을 이용하여 단백질을 동정하였다.이때 rat 단백질 분석을 위해 IPI rat 데이터베이스(version 3.
- Rat 1 세포로부터 확인된 각각의 인산화 단백질을 세포내의 위치와 분자적 기능에 의해 분류하였다. 확인된 인산화 단백질의 분자적 기능은 Gene ontology(GO)에 의해 분석되었다(Fig. 3A). 이것은 GO annotation terms을 사용하여 분리하였다.
성능/효과
- 이 결과는 TiO2를 이용한 인산화 펩타이드의 농축과 질량분석기를 통한 인산화 펩타이드 및 인산화 위치 동정하는 방법이 효과적으로 진행되고 있음을 예비 실험으로 잘 보여주고 있다.
- 이를 위해 두 가지 분리 전략(C4 및 양이온 교환 수지)을 이용한 결과, 단백질 상태에서 C4를 이용해서 분리 후 이를 펩타이드화 한 후, TiO2를 이용하여 농축하는 방법이 더 효과적이었다. 규명된 인산화 펩타이드를 기반으로 인산화 단백질의 기능 및 위치 등을 확인한 결과 분석이 어려운 막단백질들에서 새로운 인산화 위치를 갖는 단백질들까지도 찾을 수 있음을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 한 가지 세포를 이용하여 전체적인 인산화 단백질을 연구하는 방법에 대한 것을 제시하였으며 이는 여러 가지 신호를 세포에 처리한 후 변화되는 인산화 단백질들의 양적인 변화들을 확인하는 데 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 단백질 동정을 위한 파라미터로는 fixed modification에 carbarmidomethyl C, variable modification 에 oxidation M을 선택하였고 트립신missed cleavage는 2개, 이온 허용 한계는 0.1 Da으로 설정하고 분석결과는 >95%의 정확도를 가지는 2개 이상의 펩타이드로부터 얻어진 단백질만을 최종 결과로 얻었다.
- 3B는 세포내 위치를 보여주고 있다. 대부분이 intracellular part 및 cytoplasm에 존재하였고, plasma membrane part, intracellular organelle part, cytoskeletal part, MHC protein complex 등에 존재하는 것으로 보여졌다. 또한 인산화 펩타이드 내에 몇 개의 인산기가 있는지를 기준으로 분류를 해 보았다(Fig.
- 본 연구에서 확인된 인산화 펩타이드들 중에서 특히 세포 신호전달에 관여하는 인산화 위치를 규명하였고, 그 중에서도 기존의 방법으로 규명하기 어려운 막단백질로부터 동정한 인산화펩타이드들을 표로 나타내었다(Table I).
- 세포내에 존재하는 수많은 인산화 단백질들 및 인산화 위치를 질량분석기를 통해 전체적으로 확인하는 방법을 Rat 1 세포를 이용하여 수행하였다. 이를 위해 두 가지 분리 전략(C4 및 양이온 교환 수지)을 이용한 결과, 단백질 상태에서 C4를 이용해서 분리 후 이를 펩타이드화 한 후, TiO2를 이용하여 농축하는 방법이 더 효과적이었다. 규명된 인산화 펩타이드를 기반으로 인산화 단백질의 기능 및 위치 등을 확인한 결과 분석이 어려운 막단백질들에서 새로운 인산화 위치를 갖는 단백질들까지도 찾을 수 있음을 보여주었다.
- 이 결과를 통해 알 수 있는 것은, 양이온 교환수지의 경우, 몇 가지 단점을 가지고 있음을 알 수 있었다. 첫째, 양이온 교환수지의 분리능이 C4에 비해 떨어지고, 둘째, 양이온 교환수지의 경우 분획내에 염(salt)를 포함하고 있어 이는 TiO2의 효율을 떨어뜨렸을 가능성이 커서, 인산화 펩타이드의 양을 감소시켜 질량 분석기에 의한 분석 효율을 감소시켰을 것으로 추정된다.
후속연구
- 규명된 인산화 펩타이드를 기반으로 인산화 단백질의 기능 및 위치 등을 확인한 결과 분석이 어려운 막단백질들에서 새로운 인산화 위치를 갖는 단백질들까지도 찾을 수 있음을 보여주었다. 따라서 본 연구에서 한 가지 세포를 이용하여 전체적인 인산화 단백질을 연구하는 방법에 대한 것을 제시하였으며 이는 여러 가지 신호를 세포에 처리한 후 변화되는 인산화 단백질들의 양적인 변화들을 확인하는 데 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
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