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문제 정의
- 고욤나무에 대한 연구는 주로 고욤씨 및 열매를 위주로 이루어 졌으며 잎을 대상으로 한 연구는 거의 없으며 최근에 저자 등에 의해 고욤잎 추출물과 분획물의 항산화 및 alpha-glucosdiase 저해 활성 및 플라보노이드 화합물의 정량을 보고한바 있다. 10) 본 연구에서는 α-glucosidase 저해 활성을 탐색하던 중 고욤나무 잎의 메탄올 추출물중 대조 약물로 사용한 acarbose에 비하여 월등한 저해활성을 나타내는 부탄올 분획물 함유된 활성물질을 분리 정제하기 위하여 in vitro α-glucosidase 저해 활성을 지표로 하여 활성 유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 따라 고욤나무 잎 추출물의 분리, 정제를 시도하였다.
제안 방법
- 고욤나무 잎 표본(JSI-01)은 전주생물소재연구소에 보관하고 있다. 채취된 고욤나무 잎은 즉시 증류수로 세척한 후 5분간 증기찜을 한 후 실온에서 선풍기를 활용하여 건조하였으며, 최종적으로 건조기에o서 40 C로 12시간 동안 건조하여 분말로 제조하였다.
- Louis, MO, USA) 로부터 구입하여 사용하였다. 추출, 분리 및 정제를 사용한 용매는 모두 특급(GR) 및 1급1 13시약을 사용하였으며, H-NMR 및 C-NMR spectrume Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)을 이용하여 측정하였다. Column chromatography는 silica-gel(230-400 mesh, merck)을 사용하였고, TLC는 Kiesel gel 60 F254(0.
- 1mg/mL)o25µL을 넣어 37 C에서 30분간 반응시킨 후 1N-NaOH 25µL를 첨가하여 발색시켰다. 이때 생성된 ρ-nitrophenol (PNP)은 400nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 양은 표준물질 ρ-nitrophenol로부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다. Acarbose(1.
- 80 g을 각각 얻었다. α-glucosidase 활성이 우수한 n-BuOH 분획물 5g을 용출용매 CHCl3:MeOH=97:3→ 60:40로 silica-gel(230-400 mesh, 800g) column(Ø=5.0× 100cm) chromatography를 실시하여 총 17개의 분획으로 나누었다. 그 중 활성을 측정한 뒤 효능이 우수한 분획 Fr.
- 1). 따라서 고욤나무 잎 추출물에 함유된 α-glucosidase 활성 저해 성분들은 주로 n-BuOH 분획물에 분포하는 것으로 예측되어 이 n-BuOH 분획물로부터 활성 저해성분들의 분리 정제를 시도하였다. 우선 n-BuOH 분획물을 silica gel column chromatography를 실시하여 Fr.
- 당뇨병에 효과 있는 천연물 소재의 탐색하여 과학적인 실험근거를 목적으로 소장 흡수 저해효소인 α-glucosidase를 target로 저해율을 조사하였다. 소재중에 우리나라 고유의 생약 자원인 고욤잎을 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 따라 분리, 정제를 시도 단일 물질로 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside(myricitrin)을 얻었다.
대상 데이터
- 실험재료 −본 실험에 사용된 시료는 전라북도 진안군 부귀면 수항리 신기마을에서 2013년 6월 30일에 채취하였다. 고욤나무 잎의 동정은 마을 주민으로부터 확인한 후 최종적으로 우석대학교 한의과대학 본초방제학교실 김홍준 교수님으로부터 동정을 받았다.
- 기기 및 시약 −본 실험에 사용된 α-glucosidase, p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside(p-NPG), myrcetine Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 로부터 구입하여 사용하였다. 추출, 분리 및 정제를 사용한 용매는 모두 특급(GR) 및 1급1 13시약을 사용하였으며, H-NMR 및 C-NMR spectrume Jeol JMN-EX 400 spectrometer(Japan)을 이용하여 측정하였다.
- ) column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4 EtOH 용액을 사용하였으며, UV의 검색은 254와 365nm에 측정하였다.
- 이때 생성된 ρ-nitrophenol (PNP)은 400nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 양은 표준물질 ρ-nitrophenol로부터 작성한 표준곡선으로부터 구하여 다음의 식으로 저해율을 구하였다. Acarbose(1.0 mg/mL)을양성 대조구로 사용하였다.
이론/모형
- α-Glucosidase 효소저해 활성 −α-glucosidase 저해 활성을 측정하기 위하여 Tibbot 등의 방법11)에 따라 반응 혼합액은 50mM sodium succinate buffer(pH 4.2)에 ρ-nitrophenol-α-D-glucopyranoside(PNPG)를 용해시켜 1mg/mL의 농도로 기질을 만들었다. 기질 50µL와 효소액 25µL를 혼합하고 대조 구에는 증류수 25µL, 반응구에는 시료(0.
- 저해율을 조사하였다. 소재중에 우리나라 고유의 생약 자원인 고욤잎을 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 따라 분리, 정제를 시도 단일 물질로 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside(myricitrin)을 얻었다. Myricitrin의 α-glucosidase 활성을 억제하는 효과가 대조약물로 사용 한 acarbose(83.
성능/효과
- 식물추출물 대상으로 α-glucosidase 저해제를 찾기 위해 고욤나무 잎 메탄올 추출물에서 α-glucosidase 저해 효과를 나타냄을 알 수 있었으며, 92.07% 저해율을 보여주었다. 한편 동일한 실험조건 하에서 실시한 대조약물 acarbose의 저해율이 83.
- 07% 저해율을 보여주었다. 한편 동일한 실험조건 하에서 실시한 대조약물 acarbose의 저해율이 83.03%로 측정되어 고욤나무 잎 메탄올 추출물은 대조 약물 acarbose 보다 높은 효소활성 저해효과를 나타내었다.
- 또한, 메탄올 추출물을 n-hexane, CHCl3, EtOAc 및 n-BuOH로 단계적으로 용매분획하여 얻은 EtOAc 분획물 및 n-BuOH 분획물이 높은 저해효과를 나타내었다. 특히 n-BuOH 분획물의 경우 96.
- 16를 재차 prep-HPLC를 실시하여 정제한 결과, α-glucosidase에 대하여 강력한 효소저해활성을 나타내는 화합물 1을 분리하1 13였다. 화합물 1은 미황색 분말로서 H-NMR 및 C-NMR spectrum 등 각종 분광학적 data 를 문헌12, 13)과 비교하여 본결과 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside (myricitrin)로 확인되었다(Fig. 1).
- 화합물 1은 α-glucosidase 활성을 저해하였으며, 활성 저해는 98.07%로 산출되었고, 대조약물로 사용한 acarbose (83.03%)에 비하여 훨씬 강력한 활성 저해효과를 나타내었다. 한편 화합물 1과 함께 Fr.
- 12a로부터 분리된 화합물 3의 caffeic acid의 활성 저해는 10% 이하의 낮은 활성 저해율을 나타내었다. 또한 고욤나무 잎에서 분리한 화합물 1(myricitrin)의 구조와 α-glucosidase 활성 저해효과의 상호관계를 확인하기 위하여 화합물 1의 구조에 3번 위치에 rhamnoside의 1분자가 없은 고욤나무 잎 추출물의 주요성분 중의 하나로 보고된 화합물 2(myricetin)의 α-glucosidase 활성 저해효과가 대조약물로 사용한 acarbose에 버금가는 99.82%의 강력한 활성 저해효과를 나타내었다.
- 이 결과로 rhamnoside의 1분자가 α-glucosidase 활성 저해율에 구조적인 장애로 인해 약간 낮은 활성 저해율을 나타났음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 소재중에 우리나라 고유의 생약 자원인 고욤잎을 활성유도 분획법(bioactivity-guided fractionation)에 따라 분리, 정제를 시도 단일 물질로 myricetin-3-O-α-L-rhamnoside(myricitrin)을 얻었다. Myricitrin의 α-glucosidase 활성을 억제하는 효과가 대조약물로 사용 한 acarbose(83.03%)에 버금가는 98.07%의 강력한 활성 저해 효과를 나타내었다. Myricitrin의 단일성분을 직접 또는 함유된 n-BuOH 분획물을 이용하여 항당뇨활성을 직접적으로 평가할 수 있는 일련의 표준 실험을 통하여 천연물의 약이나 기능성식품 소재로의 개발가치가 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 07%의 강력한 활성 저해 효과를 나타내었다. Myricitrin의 단일성분을 직접 또는 함유된 n-BuOH 분획물을 이용하여 항당뇨활성을 직접적으로 평가할 수 있는 일련의 표준 실험을 통하여 천연물의 약이나 기능성식품 소재로의 개발가치가 있을 것으로 사료된다.
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